缝隙连接蛋白40 基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系

廖志敏，符家武，刘 根

动脉粥样硬化性脑梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)是缺血性脑卒中最常见类型，病因主要包括动脉粥样硬化、高血压、糖尿病和血脂异常等，其中脑动脉粥样硬化是ACI 发病的核心环节［1］。

近年来，许多研究表明缝隙连接蛋白40(connexin 40，Cx40)参与动脉粥样硬化的发病机制。Cx40 广泛表达于血管内皮细胞、平滑肌细胞和心房心肌细胞等，其组成的缝隙连接跨膜通道在血管壁内皮细胞、平滑肌细胞和基质等相互间的电藕联和代谢藕联中发挥重要作用［2］。Chadjichristos 等［3］研究发现特异性敲除小鼠血管内皮细胞Cx40 基因，可导致大量白细胞向血管内膜黏附，进而促进小鼠动脉粥样硬化的发病。此外，Chu 等［4］报道了动脉粥样硬化模型小鼠主动脉内皮细胞的Cx40 基因表达下调，这表明Cx40 可能起着抑制动脉粥样硬化形成的作用。

人Cx40 基因(又称GJA5 基因)位于1 号染色体长臂2 区1 带1 亚带(1q21.1)，含有2 个启动子区域和4 个外显子［5］，主要编码Cx40。2003 年，Groenewegen 等［6］在一个患有罕见家族性心房停滞的家族中首次报道了位于Cx40 基因启动子区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点rs35594137(-44 G/A)。近年来，Firouzi 等［7］报道了Cx40 基因rs35594137 位点与荷兰男性高加索人群的高血压发病密切相关。Juang 等［8］研究发现rs35594137 位点A 等位基因显著降低Cx40 基因启动子活性，并且明显增加台湾人群心房颤动的发病风险。基于此，本研究以广东汉族人群为研究对象，首次探讨Cx40 基因启动子区多态性位点rs35594137 与ACI 易感性的相关性，并分析rs35594137 位点与Cx40 mRNA 相对表达水平的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2011 年12 月～2014 年1 月在我院神经内科连续住院的初发的ACI 患者(病例组)342 例，所有患者经头部MRI 或CT 检查确诊，并符合全国第四届脑血管病学术会议通过的诊断标准［9］。排除标准:(1)过去及现在有过其他类型的缺血性卒中(主要根据TOAST 分型，如心源性脑栓塞、腔隙性脑梗死、其他明确病因或不明原因脑梗死);(2)脑出血病史;(3)心绞痛、心肌梗死和缺血性心肌病等严重冠心病史;(4)恶性肿瘤、自身免疫性疾病和严重感染等病史;(5)重大手术史。对照组选自于我院体检中心同期进行体检的健康者296 例。入组者均为广东汉族人群，相互间无血缘关系。本研究经广东医学院附属医院伦理委员会审核批准，入组者均签署知情同意书。病例组和对照组的年龄、性别具有可比性，一般临床资料(见表1)。

1.2 实验方法

1.2.1 基因型检测 所有研究对象常规禁食12 h，并于清晨抽取外周静脉血2 ml，血液样本收集于枸橼酸钠(EDTA-Na)抗凝管，并采用DNA 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取血液基因组DNA。病例组和对照组Cx40 基因启动子区rs35594137 位点基因型检测采用SNaPshot 技术(Applied Biosystems，USA)［10］，操作过程主要包括PCR 反应、单碱基延伸反应和多态性位点序列检测，其中PCR 引物设计和合成均由上海天昊生物科技有限公司完成，上游引物序列:5’-CCCTCTTTTTAATCGTATCTGTGGC-3’;下游引物序列:5’-GGTGGAGGGAAGAAGACTTTTAG-3’。

1.2.2 单个核细胞总RNA 提取和荧光定量PCR 随机选取50 例病例组患者和50 例对照组健康体检者，均采集清晨空腹外周静脉血2 ml，按照密度梯度离心法提取外周血单个核细胞，并根据TRIzol 法提取单个核细胞总RNA，总RNA 浓度和完整性检测分别采用美国Nanodrop 公司的紫外分光光度计和变性琼脂糖凝胶电泳方法。根据cDNA 反转录试剂盒(Thermal Scientificx)操作说明将总RNA反转录为cDNA，外周血单个核细胞Cx40 mRNA 表达量检测采用荧光定量PCR 方法，并以管家基因GADPH 作为内参对结果进行标准化。荧光定量PCR 引物设计和合成均由上海天昊生物科技有限公司完成，其中Cx40 基因上游引物序列:5’-AAAAAGCGTGGGCAGTTGGAG-3’，Cx40 基因下游引物序列:5’-CCAGCACGAGCATACGGAATA-3’;GAPDH 基因上游引物序列:5’-GAAGGGCTCATGACCACAGTCCAT-3’，GAPDH 基因下游引物序列:5’-TCATTGTCGTACCAGGAAATGAGCTT-3’。每个cDNA 样本重复3 次荧光定量PCR 检测，采用2-ΔΔCt值计算Cx40 mRNA 相对表达量。

1.3 统计学处理 采用直接计数法计算两组基因型和等位基因频率;两组的基因型和等位基因频率分布比较、哈迪-温伯格定律(Hardy-Weinburg equilibrium，HWE)检测均采用χ2检验或Fisher 确切概率法;计量资料采用均数±标准差()表示，组间均数比较采用t 检验。数据统计分析采用SPSS 19.0 软件，均为双侧检验，其中P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料 病例组吸烟率、高血压患病率、2 型糖尿病患病率、空腹血糖、总胆固醇(CHOL)和低密度脂蛋白(LDL)明显高于对照组，病例组高密度脂蛋白(HDL)明显低于对照组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)(见表1)。

表1 病例组及对照组的一般临床资料比较

2.2 各组Cx40 基因rs35594137 位点的基因型和等位基因频率分布 病例组与对照组的Cx40基因rs35594137 位点基因型频率分布均符合哈迪-温伯格定律(P=0.88 和P=0.16)，群体代表性好。病例组rs35594137 位点的GG、AG 和AA 基因型频率分别是38.6 %、47.4%和14.0%;对照组分别是48.6 %、44.6%和6.8%，两组比较差异有统计学意义(GG vs AG vs AA:P=0.003。显性模型AA+AG vs GG:P=0.011;隐性模型AA vs AG+GG:P=0.003);病例组rs35594137 位点A 等位基因频率明显高于对照组，差异有统计学意义(37.7% vs 29.1%，P=0.001，OR=1.479，95%CI=1.169～1.871)(见表2)。

2.3 病例组和对照组Cx40 mRNA 表达水平的差异和rs35594137 位点多态性对Cx40 mRNA 相对表达水平的影响 随机选取的50 例病例组ACI 患者外周血单个核细胞Cx40 mRNA 相对表达量明显低于50 例对照组(约0.65 倍)，差异有统计学意义(P ＜0.001)(见图1);对50 例对照组rs35594137位点的基因型与Cx40 mRNA 相对表达水平关系进一步分析，结果显示AG +AA 基因型(A 等位基因携带者)的外周血单个核细胞Cx40 mRNA 相对表达量低于GG 基因型(约0.82 倍)，差异有统计学意义(P ＜0.001)(见图2)。

表2 两组Cx40 基因rs35594137 位点基因型和等位基因频率分布比较

3 讨论

ACI 最常见病因是动脉粥样硬化，脑动脉粥样硬化性闭塞或血栓形成是导致ACI 发病的主要病理机制。目前认为，各细胞间相互的信息通讯失调是动脉粥样硬化发生和发展的重要环节。而缝隙连接作为广泛存在于哺乳类动物各种组织和细胞的一种允许相邻细胞相互间进行信息物质交换的细胞膜通道，在血管内皮细胞损伤和血管平滑肌增生等病理过程中发挥重要作用，与动脉粥样硬化的发病密切相关［11］。

近年来，已有动物实验初步证实Cx40 可能起着抑制动脉粥样硬化形成的作用。Cx40 基因单核苷酸多态性与多种心脑血管疾病易感性的相关性研究日趋增加。Juang 等［8］发现rs35594137 位点通过影响Cx40 基因启动子活性，引起Cx40 基因表达下调，进而增加心房颤动的发病风险。而Pfenniger 等［12］报道了瑞士高加索人群Cx40 基因多态性位点rs35594137 与冠状动脉粥样硬化性心脏病易感性无关。据我们所知，国内外目前尚未见Cx40 基因多态性与ACI 易感性的相关研究报道。

本次研究发现吸烟、高血压、2 型糖尿病以及高血脂(特别是CHOL 和LDL)是ACI 发病的危险因素，而HDL 是ACI 发病的保护因素。因此，戒烟，尽早控制血压、血糖和纠正血脂异常可能是降低ACI发病率的有效干预措施。此外，病例组rs35594137位点的基因型频率分布与对照组比较，差异有统计学意义(显性模型AA +AG vs GG:P=0.011，OR=1.507，95% CI=1.100～2.066);病例组rs35594137位点A 等位基因频率明显高于对照组(37.7 % vs 29.1 %，P=0.001，OR=1.479，95 %CI=1.169～1.871)。这表明A 等位基因携带者(AA +AG 基因型)可能增加ACI 发病的易感性。同时，我们发现病例组患者外周血单个核细胞Cx40 mRNA 相对表达量大约是对照组的0.65 倍;A 等位基因携带者外周血单个核细胞Cx40 mRNA 相对表达量大约是GG 基因型的0.82 倍，差异均有统计学意义。

图1 病例组和对照组外周血单个核细胞Cx40 mRNA 相对表达水平比较

图2 Cx40 基因rs35594137 位点不同基因型Cx40 mRNA 相对表达水平比较

基于此，我们推测rs35594137 位点的A 等位基因通过降低Cx40 基因启动子活性，引起Cx40 mRNA表达下调和Cx40 蛋白合成减少，促进动脉粥样硬化的形成，从而参与ACI 的发生与发展。值得一提的是，本次研究显示广东汉族健康对照人群rs35594137 位点A 等位基因频率是29.1 %，与之前研究的台湾人群［8］和北京汉族人群［13］结果相近(A等位基因频率分别是28.5%和30.0%)，但明显高于荷兰高加索人群(A 等位基因频率是20.0%)［7］。这表明Cx40 基因rs35594137 位点多态性具有种族差异性。综上所述，Cx40 基因启动子区多态性位点rs35594137 与ACI 易感性相关，A 等位基因可能通过引起Cx40 基因表达下调成为ACI 发病的危险因素。然而，为了更加明确Cx40 基因多态性与ACI 易感性的关系，更大样本量、不同种族人群和Cx40 基因其他多态性位点与ACI 的相关性研究需要进一步开展。

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