不完全弗氏佐剂诱导的髓样细胞抑制T 细胞活性①

刘雨晴 尹宝靓 姚毅波 王子兵③ (新乡医学院第三附属医院肿瘤科，新乡 453003)

长期以来，肿瘤疫苗是免疫治疗领域研究的重要内容之一，然而临床或临床前的试验结果显得不甚理想［1］。为了最大限度提高癌症疫苗的疗效，目前大多数研究致力于选择合适的肿瘤抗原、优化抗原肽与提高抗原提呈细胞及T 细胞之间的相互作用和阻断肿瘤诱导的免疫抑制机制［2-4］。然而，作为疫苗的重要组成成分之一的佐剂却没有引起足够的重视。到目前为止，人们仍然不清楚肿瘤疫苗疗效不佳的原因是否与佐剂使用不当有关。在本项研究中，我们发现肿瘤疫苗研究中最常用的IFA 能够诱导一群具有免疫抑制作用的髓样细胞。

1 材料与方法

1.1 小鼠和细胞系 BALB/c 小鼠(6～8 周)购自维通利华(北京)。所有小鼠均饲养于中科院生物物理研究所SPF 级动物房。TSA 细胞系来自BALB/c 小鼠，用含10% NCS 的RPMI1640 培养基培养。

1.2 流式细胞检测 用两片载玻片磨脾，用PBS悬起，用金属网过滤，用红细胞裂解液裂解，将得到的细胞沉淀重悬于含2%小牛血清的PBS 溶液中，4℃，1 500 r/min 离心5 min，收集细胞;加入荧光标记的抗体溶液，冰上避光孵育30 min;FACS Buffer洗去多余的抗体，将细胞重悬于300 μl FACS Buffer中;FACSCalibur 检测样品荧光。

1.3 CD11b+细胞分离 分离CD11b+细胞时，将5×106～6×106个脾细胞悬于PBS，然后与5 μg生物素化的Anti-CD11b mAb 共同孵育15 min。用PBS 洗涤两次后与链酶亲和素磁珠4℃孵育15 min。然后用MiniMACS 柱分离CD11b+细胞。

1.4 细胞增殖能力分析 将正常小鼠的脾细胞铺到96 孔板上，用Con A 作为刺激源，然后加入PBS或IFA 注射后第7、14 和21 天时从对照小鼠(PBS处理)或IFA 处理小鼠脾脏中分离的CD11b+细胞培养。72 h 后向各孔中加入四甲基偶氮唑蓝(MTT)，在37℃培养箱中继续培养4 h，去掉上清，向各孔中加入二甲基亚砜。495 nm 处读取吸光度值。结果以相对OD 值进行计算，其计算方法是:每个孔检测值/不含CD11b+细胞孔的平均OD 值。

1.5 细胞因子检测 将TSA 肿瘤细胞用γ 射线照射，然后免疫小鼠，14 d 之后制备脾单细胞悬液，以2 × 106/孔的浓度铺到24 孔板上，然后向各个孔中加入照射的TSA 细胞进行刺激(与脾细胞的比例为1 ∶40)。为了评价CD11b+细胞对IFN-γ 分泌量的影响，在上述体系中分别加入4 × 105个PBS 或IFA注射后第14 天时取得的对照组小鼠或IFA 免疫小鼠的CD11b+细胞。培养3、5 和7 d 后，使用ELISA试剂盒检测上清中的IFN-γ 量。收集上清，检测细胞因子IFN-γ 的分泌量。

2 结果

2.1 IFA 可诱导CD11b+细胞产生 根据我们以前的研究，单次注射CFA 可诱使小鼠脾脏增大，脾细胞总数增加［5］。对大颗粒细胞进行分析发现，IFA处理的小鼠脾脏中CD11b+细胞明显增多。对这群细胞进行进一步分析发现，大多数CD11b+细胞都表达Gr-1 分子，并且Gr-1 分子的荧光强度明显小于对照组(图1)。

2.2 CD11b+细胞低表达MHCⅠ类分子 我们接着比较了PBS 处理组和IFA 处理组CD11b+细胞的分子表型区别。与正常小鼠，相比接受IFA 处理的小鼠脾脏中CD11b+细胞上CD80、CD69、CD54、CD106和CD11c 的表达没有明显不同(结果未显示)，但组织相容性抗原复合物分子H2-Kd的表达明显降低(图2)。

图1 IFA 处理的小鼠脾脏中CD11b+细胞增多Fig.1 Increased CD11b+ cells in spleen of IFAtreated mice

图2 IFA 诱导的CD11b+细胞MHCⅠ类分子表达水平降低Fig.2 Low level expression of MHCⅠmolecule in IFAinduced CD11b+ cells

图3 IFA 诱导的CD11b+细胞抑制T 细胞增殖Fig.3 IFA-induced CD11b+ cells inhibit T cell proliferation

图4 IFA 诱导的CD11b+细胞抑制IFN-γ 的产生Fig.4 IFA-induced CD11b+ cells inhibit IFN-γ production

2.3 CD11b+细胞抑制T 细胞增殖 为了确定IFA诱导的CD11b+细胞是否直接影响T 细胞增殖，将制备好的正常小鼠来源的脾细胞与IFA 诱导的CD11b+细胞共同孵育，并使用Con A 作为T 细胞增殖的刺激剂。结果显示，与对照组相比，IFA 诱导的CD11b+细胞提示能够明显抑制T 细胞增殖(图3)。

2.4 CD11b+细胞抑制T 细胞产生IFN-γ IFN-γ主要是血源性细胞分泌［6，7］，与肿瘤的排斥密切相关。将从TSA 细胞免疫后小鼠分离的脾细胞与从PBS 或IFA 免疫小鼠分离的CD11b+细胞共同培养，然后用照射后的TSA 细胞作为刺激原进行刺激。培养第5 天和第7 天检测发现，TSA 免疫脾细胞(主要是T 细胞)能产生大量的IFN-γ。当加入IFA 诱导的CD11b+细胞后，免疫脾细胞分泌IFN-γ 的量大大减少。这些结果表明，CD11b+细胞能够抑制IFNγ 的产生。

3 讨论

佐剂是肿瘤疫苗的重要组成部分。然而，佐剂是怎样影响疫苗的治疗效果还不是很清楚。前期的研究发现，完全弗氏佐剂(CFA)和IFA 均可诱导小鼠产生CD11b+细胞，并且CFA 诱导的这群细胞能够通过抑制T 细胞产生IFN-γ 和促进T 细胞凋亡而发挥免疫抑制作用，但没有对IFA 诱导的该群细胞进行进一步的研究［5］。本项研究发现，IFA 诱导的CD11b+细胞同样具有免疫抑制功能。这些发现有助于解释使用弗氏佐剂的肿瘤疫苗为什么临床效果总是不佳，从而强调了肿瘤主动免疫治疗时佐剂选择的重要性。

IFA 诱导的CD11b+细胞与肿瘤诱导的骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)有许多共同特征。例如，它们都表达CD11b 和Gr-1［8，9］。然而，它们之间仍有一些差异存在。表型上，CD11b+细胞较少表达MHC Ⅰ类分子。在功能上，CD11b+细胞抑制Con A诱导的T 细胞增殖，抑制肿瘤抗原诱导的T 细胞分泌IFN-γ。关于抑制机制仍需要更多的研究证实。

我们的发现具有重要的临床意义。其中一点就是体内阻断CD11b+的生成或者功能可能会阻断疫苗中弗氏佐剂的破坏作用。有意思的是，体外已有研究证明干扰其功能可减轻肿瘤诱导的MDSC 对T细胞的抑制作用、恢复T 细胞功能和部分恢复抗肿瘤免疫效果［10］。这一结果指出了一种可以改善肿瘤免疫效果的方法。

［1］Rosenberg SA，Yang JC，Restifo NP.Cancer immunotherapy:moving beyond current vaccines［J］.Nat Med，2004，10:909-915.

［2］Rosenberg SA.A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens［J］.Immunity，1999，10:281-287.

［3］Srivastava PK.Immunotherapy of human cancer:lessons from mice［J］.Nat Immunol，2000，1:363-366.

［4］Pardoll DM.Spinning molecular immunology into successful immunotherapy［J］.Nat Rev Immunol，2002，2:227-238.

［5］Wang Z，Jiang J，Li Z，et al.A myeloid cell population induced by Freund adjuvant suppresses T-cell-mediated antitumor immunity［J］.J Immunother，2010，33:167-177.

［6］Blankenstein T，Qin Z.The role of IFN-gamma in tumor transplantation immunity and inhibition of chemical carcinogenesis［J］.Curr Opin Immunol，2003，15:148-154.

［7］Dunn GP，Koebel CM，Schreiber RD.Interferons，immunity and cancer immunoediting［J］.Nat Rev Immunol，2006，6:836-848.

［8］Sica A，Bronte V.Altered macrophage differentiation and immune dysfunction in tumor development［J］.J Clin Invest，2007，117:1155-1166.

［9］Gabrilovich D.Mechanisms and functional significance of tumourinduced dendritic-cell defects［J］.Nat Rev Immunol，2004，4:941-952.

［10］Mazzoni A，Bronte V，Visintin A，et al.Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism［J］.J Immunol，2002，168:689-695.