猪脂肪发育相关miRNAs的功能研究进展

陈 晨，胡雄贵，朱 吉，任慧波，邓 缘，彭英林

(湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410131)

猪脂肪发育相关miRNAs的功能研究进展

陈 晨*，胡雄贵，朱 吉，任慧波，邓 缘，彭英林*

(湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410131)

脂肪组织与猪肉品质密切相关，是影响猪胴体品质的一大因素。了解猪脂肪组织的生长发育及代谢调控机制，对于畜牧生产及疾病治疗具有重大意义。miRNAs(microRNAs)是一类内源性的、非编码的、长度为18～24 nt的小分子RNA，其主要通过调控基因表达的转录后水平起作用。大量研究表明，miRNAs参与调控脂肪细胞分化、脂肪形成、脂肪酸代谢、胆固醇合成等多个生命过程。然而目前已报道的猪miRNAs仅有326个，且miRNAs调控猪脂肪发育的研究十分欠缺。本文对近年来猪脂肪相关miRNAs的挖掘和鉴定研究工作进行回顾，同时也关注了miRNAs调控猪脂肪发育的研究。

猪；脂肪发育；miRNAs；调控机制

猪是重要的农业经济动物，也是中国第一大肉品来源。脂肪组织与肉品质密切相关，是影响猪肉品质的一大因素，同时胴体瘦肉率也是评估胴体品质的一个重要方面。因此，脂肪组织的发育和肉品质一直受到科学家们的广泛关注，对猪脂肪组织的生长发育及代谢调控研究具有重要的经济意义。miRNAs是一类内源性的、进化高度保守的非编码小分子RNA。许多研究已表明，miRNAs在调控体外和体内脂肪形成过程中扮演着重要角色。迄今为止，最新miRBase数据库中(Release 20)(http：//www.mirbase.org/)可查询到的人和小鼠的成熟miRNAs分别达到2 578个和1 908个，而猪中仅有326个，且miRNAs调控猪脂肪发育的研究十分欠缺，因此猪miRNAs的数量和功能亟待持续挖掘和深入探索。

本文综述了近年来猪脂肪相关miRNAs的挖掘和鉴定工作，也特别关注了miRNAs调控猪脂肪发育的研究进展。

1 脂肪形成概述

脂肪组织是体脂合成的主要器官，同时也是储存脂肪细胞的主要场所。除提供能量外，它还具有维持体温，缓冲外界机械冲击，保护内脏器官、分泌脂肪因子和调节生理机能等作用[1-2]。其中脂肪细胞的形成对脂肪组织的发育起着举足轻重的作用。

目前普遍认为脂肪细胞来源于多潜能干细胞，其经历脂肪母细胞和前脂肪细胞，最终分化形成成熟的脂肪细胞。前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化过程由多种分化转录因子调控，并伴随一系列成脂基因和脂代谢合成酶基因的时序表达(图1)。前脂肪细胞的分化首先要经历细胞生长的抑制阶段，即细胞长满达到接触抑制，退出细胞周期并停止有丝分裂。此时脂肪细胞早期分化标记基因脂蛋白脂肪酶(LPL)和前脂肪细胞因子1(pref1)高表达。接着在分化诱导剂(Insulin、DEX和IBMX)的刺激作用下，细胞再次进入细胞周期并进行两轮有丝分裂克隆扩增，然后多种分化转录因子开始表达，主要的转录调控因子有CAAT/增强子结合蛋白δ、β、α(C/EBPδ、β、α)，脂肪细胞分化决定因子1/固醇调节元件结合蛋白1c(ADD1/SREBP1c)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)。此后这些转录因子启动脂肪形成相关基因的表达，如激素敏感性脂肪酶(HSL)、乙酰辅酶A脱羧酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、脂肪酸结合蛋白(ap2/FABP4)、脂联素(adiponectin)和葡萄糖转运蛋白(GLUT)等。此阶段细胞形态由纤维状逐渐趋于椭圆形或圆形，胞内出现小脂滴，随后细胞进入脂滴累积的终端分化状态[3-5]。

图1 脂肪细胞分化的过程示意图Fig.1 Schematic of process of adipocyte differentiation

2 miRNA的生成和作用机制

miRNA是一类内源性的、物种间保守的、具有时空组织特异性的、长度为18～24 nt的非编码小分子RNA[6]。1993年，科学家们首次在秀丽新小杆线虫中发现了具有调节其发育时序性的miRNA，即lin-4。lin-4与靶mRNAlin-14的3′UTR反向互补结合，从而抑制了lin-14基因的翻译[7]。第2个miRNA let-7也于2000年被发现[8]，其与lin-4和daf-12基因的3′UTR互补配对结合，进而抑制靶mRNA的翻译。

动物中miRNA的生成是一个多步骤的复杂进程，大致可分为3个阶段(图2)：①核内miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录出一个长的初级转录本，即primary-miRNA(pri-miRNA)，长度从几百至几千个核苷酸不等，此初级转录本含有成熟的miRNA及多个茎环结构；②pri-miRNA被RNase Ⅲ Drosha和DGCR8形成的蛋白复合物识别并剪切形成具有发卡结构、长度约为70 nt的前体miRNA，即precusor-miRNA(pre-miRNA)；③pre-miRNA被转运蛋白Exportin-5 从细胞核转运至细胞质中，细胞质中的RNase Ⅲ Dicer酶及结合蛋白将pre-miRNA切割成长度约为22 nt的双链miRNA，即miRNA：miRNA*。随后，双链迅速解螺旋，其中一条链降解，另一条链即为成熟的miRNA。成熟的miRNA结合RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)后再与靶基因结合发挥转录后调控作用[9]。

miRNA主要以两种方式抑制靶基因的表达：靶mRNA的剪切降解和翻译抑制。RISC中的AGO蛋白引导miRNA识别靶基因，当miRNA序列与靶mRNA序列完全配对时引起靶mRNA的剪切和降解，这种情况多见于植物中。而部分碱基互补配对(通常是miRNA的“种子序列”即第2～8 nt与靶mRNA的结合)则倾向于抑制靶mRNA的翻译，此种作用多见于动物中[10]。以前的研究认为，成熟的miRNA只与靶mRNA的3′UTR结合发挥调控作用，然而近来的研究表明miRNA还可与5′UTR及CDS区结合[11-12]，这表明miRNA可通过多种复杂的途径来调控基因的表达从而影响生命过程。

图2 miRNA的生物合成过程及其作用机制[9]Fig.2 A model for miRNA biogenesis process and its targeting mechanism[9]

3 猪脂肪相关miRNAs的挖掘和鉴定

miRNAs的挖掘方法主要包括生物信息学预测、cDNA克隆测序和高通量测序等技术。鉴定miRNAs最经典的方法是被誉为“金标准”的RNA印迹(Northen blotting)，其次还有实时定量PCR(qPCR)、原位杂交和芯片等技术。

基于猪基因组测序任务的逐步完成，以及在人和小鼠上鉴定出了相对较多的miRNAs，计算机同源搜索起初成为挖掘猪miRNAs的首要方法[13-14]。R.Wernersson等[13]于2005年采用这种方法对猪基因组进行扫描，共筛选出51个成熟miRNAs，这也是第一篇关于猪miRNAs的报道，这项研究对后续miRNAs的挖掘具有重要指导意义。虽然生物信息学方法可以从全基因组中快速挖掘大量潜在的miRNAs，但预测分析结果仍需进一步试验验证。

此后，多位专家学者开始采用cDNA克隆测序方法对猪miRNAs进行挖掘，并采用“夹板连接法”对miRNAs进行鉴定[15-16]。I.S.Cho等[16]在180日龄巴克夏猪的背最长肌和35日龄杜长大三元杂交猪的背部脂肪组织中共克隆出89个miRNAs，其中miR-16、miR-21、miR-199a和miR-199a*在脂肪组织中显著高表达，而miR-130b、miR-339、miR-450b*、miR-542*和miR-574*则表现出脂肪特异性。这是猪中首次将脂肪组织作为单列研究对象进行miRNAs的挖掘鉴定工作，其研究结果为深入探索这些miRNAs的生物学功能奠定了良好基础。cDNA克隆测序方法虽然可靠性高，但耗时长、效率低，很难鉴定低丰度或组织细胞特异表达的miRNAs，这也限制了此方法的大规模应用和推广。

随着科学技术的发展，高通量测序方法的出现极大促进了miRNAs的挖掘鉴定工作，同时猪脂肪相关miRNAs的研究也进入了飞速发展时期。

早在2009年，A.M.Reddy等[17]采用454测序方法对10月龄杂交猪的心、肝与胰腺组织的miRNAs进行测序，测序结果采用Northern blotting法进行试验验证。结果共鉴定出120个保守的miRNAs，其中miR-194在肝中显著高表达，miR-122则表现出肝特异性。2011年，S.S.Xie等[18]利用芯片技术对Solexa测序鉴定出的miRNAs在脂肪型通城猪和瘦肉型大白猪的肝中进行差异表达的检测，并结合RT-PCR和Northern blotting法对miRNAs在多个组织中进行验证。结果共筛选出miR-143和let-7等58个表达差异的miRNAs。研究也证实，miR-143和let-7在人、小鼠和猪的脂肪细胞分化、脂肪形成及脂肪酸代谢过程中扮演着重要角色[19-22]。肝也是脂肪代谢的重要器官，在脂肪的合成和释放、脂肪酸分解、胆固醇与磷脂的合成、脂蛋白的合成及运输等生理过程中发挥着重要作用。因此，梅山猪和大白猪肝差异miRNAs的鉴定在一定程度上为揭示脂肪形成的分子机制提供参考。同年，C.Chen等[23]以Illumina高通量平台为研究手段，以杜洛克与二花脸F2代在脂肪沉积和生长上存在显著差异的全同胞雌性个体为研究对象，分别对两个体的肝、背最长肌和腹部脂肪共6个样品进行miRNAs的挖掘。测序结果发现了348个成熟miRNAs(164个潜在的新的miRNAs)，其中86个新的miRNAs是腹脂特异存在的，表明这些miRNAs可能调控猪的脂肪沉积过程，为脂肪发育规律的深入研究提供新的理论素材。

2011年，G.Li等[24]以7日龄荣昌仔猪和240日龄荣昌大猪的背部脂肪组织为试验材料，采用Solexa方法对两个样品的miRNAs库进行高通量测序分析。共鉴定出227个成熟miRNAs，其中miR-122、miR-103/107和miR-224等93个miRNAs在大猪背脂中显著上调表达，miR-205、miR-493和miR-136等33个miRNAs显著下调表达，揭示这些miRNAs可能在猪脂肪发育和沉积过程中发挥各种生理调控作用。已有研究显示，miR-122增加肝脂肪酸氧化、抑制胆固醇合成[25]；饲喂高胆固醇日粮的哥廷根迷你猪具有较高的体重、总胆固醇水平和高密度脂蛋白含量[26]，这些表征与miR-122的低水平表达有关，暗示了miR-122与猪肥胖之间的相关性；miR-103加速猪前脂肪细胞的分化、促进脂滴积累[27]；miR-224阻碍小鼠3T3-L1细胞早期成脂分化[28]。这些研究发现从侧面支持了测序结果的准确性，而测序结果也为这些研究成果提供依据。然而大部分差异表达miRNAs介导调控脂肪发育的生理功能仍不清楚，具体的分子机制有待深入研究。

最近，本课题组以150日龄瘦肉型大白猪和脂肪型梅山猪的背部脂肪组织为试验材料，采用Solexa深度测序方法在两样品中共鉴定出215个成熟miRNAs[29]，其中9个miRNAs在两样品中存在极显著差异，即miR-215、miR-224、miR-135和miR-146b在大白猪中高表达；miR-1a、miR-133a、miR-122、miR-204和miR-183在梅山猪中高表达。本小组后续的研究也证实miR-224[28]和miR-135[30]抑制前脂肪细胞分化和脂肪形成，而miR-183则具有相反的生理功能[31]。此研究结果不仅验证了Solexa测序结果的准确性和可靠性，同时也为揭示miRNAs调控脂肪形成的表观分子机制、剖析中外猪种肉质性状差异的遗传机理提供了分子依据。

肌内脂肪是影响猪肉品质的主要性状之一，对肌肉的嫩度、风味和多汁性具有重要的影响[32-33]。但肌内脂肪在发育和代谢上都与其他脂肪组织存在很大差异[34-35]，其形成和调控机制仍不清晰。基于此，Y.Guo等[36]分离得到猪的肌内血管干细胞(IVSC)和皮下血管干细胞(SVSC)，采用Solexa测序比较了二者在成脂分化过程中miRNAs组(microRNAome)差异，并采用qPCR方法对其中一些miRNAs进行试验验证和组织表达谱分析。结果发现了224个已知猪miRNAs和280个潜在miRNAs，其中54个miRNAs在IVSC和SVSC分化过程中具有相似的表达模式，10个miRNAs具有相反的表达模式。此研究结果为解析肌内和皮下脂肪形成及差异分子机制提供新的理论依据。

4 miRNAs调控猪脂肪发育的研究进展

2003年，人们在果蝇中首次发现调控脂肪代谢的miRNA[37]，即miR-14。在随后十年的研究过程中，学者们发现人和小鼠中越来越多的miRNAs在脂质代谢过程中起着重要的调控作用，包括脂肪细胞分化、血脂代谢及胰岛素抵抗和分泌等过程。而猪脂肪相关miRNAs的功能研究仅有零星报道(表1)。

表1 猪脂肪形成和脂质代谢相关miRNAs

Table 1 miRNAs associated with adipogenesis and lipid metabolism in pigs

miRNAs功能Function靶基因Target参考文献ReferencemiR⁃122胆固醇水平相关CAT1[26]miR⁃196a↑脂肪形成-[40]miR⁃103↑脂肪形成RAI14[27，44]miR⁃27a↓脂肪形成-[20]miR⁃143↑脂肪形成-[20]miR⁃145↓脂肪形成IRS1[52]miR⁃181↑脂肪形成TNFα[53]miR⁃33b↓脂肪形成EBF1[54]miR⁃199a⁃5p↓脂肪形成Cav1[58]miR⁃130b↓脂肪形成PPARγ[62，63]miR⁃374a/b-C/EBPβ[62，64]

↑.表示促进脂肪形成；↓.表示抑制脂肪形成

↑.Represents promotion of adipogenesis；↓.Represents inhibition of adipogenesis

4.1 miR-122

2005年，J.Krützfeldt等学者[38]利用反义寡核苷酸技术抑制miR-122后发现小鼠血浆胆固醇水平降低。另一项研究表明[25]，抑制小鼠miR-122导致血浆胆固醇水平降低、肝脂肪酸氧化增强、肝脂肪酸和胆固醇的合成速率降低。2010 年的研究发现，miR-122通过影响小鼠肝细胞SREBP1c、DGAT2、FAS和ACC1等基因的表达进而调控脂肪酸和甘油三酯的合成[39]。同年，S.Cirera实验室[26]发现，饲喂高胆固醇日粮的哥廷根迷你猪的体重、总胆固醇及高密度脂蛋白水平显著高于饲喂标准日粮组，而甘油三酯水平和miR-122表达量却显著低于饲喂标准日粮组。作者认为猪体重和胆固醇水平的增加与miR-122表达水平的降低有关，这与在小鼠中的研究报道一致。这些研究结果表明 miR-122 可能是治疗胆固醇和脂肪酸代谢疾病的靶标。

4.2 miR-196a

2010年，宁小敏[40]首先对3日龄和180日龄长白猪的脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺和胰腺组织中的miR-196a进行时空表达谱分析，结果发现，miR-196a在7个组织中均有表达，3日龄仔猪中miR-196a在脂肪组织中的表达量最低(相对表达量约为0.57)，而180日龄大猪中miR-196a在脂肪组织中的表达量最高(相对表达量约为16.26)，暗示miR-196a可能调控猪的脂肪组织发育进程。因此，作者进一步分析了pcDNA3.0-miR-196a超表达载体对猪原代前脂肪细胞的增殖和分化的影响。结果显示，miR-196a对猪前脂肪细胞的增殖没有明显影响，而脂肪细胞分化关键基因PPARγ、C/EBPα和LPL的表达水平和脂滴积累较对照组明显增加。2012年，J.M.Romao等[41]的研究指出，miR-196a在牛肾周脂肪组织中的表达量远远高于背部皮下脂肪组织，这说明miR-196a可能对维持脂肪库的特异性起重要作用。然而miR-196a作用的具体分子机制并不明了，仍需进行深入研究。

4.3 miR-103

2011年，G.Li等[27]从杜洛克和斯格猪的杂交公猪后代中各选择10头3日龄仔猪和180日龄大猪为研究对象，发现，miR-103在两时期猪的背部皮下脂肪组织、小脑和大脑等13个组织中广泛表达。随着背部皮下前脂肪细胞的分化，miR-103的表达量逐渐升高；反义抑制了miR-103抑制成脂基因(C/EBPα、PPARα、PPARγ和FABP4)的表达，阻碍了前脂肪细胞分化和甘油三酯积累。结果还发现，RAI14基因与miR-103的表达趋势相反，即在前脂肪细胞分化过程中，RAI14基因的表达水平逐渐降低，蛋白印迹试验证明RAI14为miR-103的靶基因。前期研究已证实，视黄酸诱导RAI14基因的表达、抑制猪前脂肪细胞的分化[42-43]，笔者推测miR-103可能通过靶向RAI14基因拮抗视黄酸对猪前体脂肪细胞分化的抑制作用，进而促进脂肪形成。

李美航等[44]将pre-miR-103腺病毒超表达载体感染猪原代前脂肪细胞后发现，成脂标记基因PPARγ和ap2的mRNA和蛋白质表达量与对照组相比显著升高，且观察到明显的脂滴生成。这说明miR-103可促进猪前脂肪细胞的发育，但遗憾的是作者并没有对miR-103的作用靶标和调控通路进行分析和验证。

4.4 miR-27a和miR-143

T.Wang等[20]应用miRNA“获得”和“缺失”技术即转染miRNA mimics和inhibitor研究miR-27a和miR-143对猪成熟脂肪细胞脂质代谢的影响，结果发现，miR-27a促进甘油和游离脂肪酸的生成，抑制甘油三酯和脂滴的形成；而miR-143则抑制甘油和游离脂肪酸的生成，促进甘油三酯和脂滴的形成。研究表明，人和鼠中miR-27和miR-143调控脂肪代谢的研究结果与猪中一致。miR-27a/b靶向成脂关键基因PPARγ和线粒体膜电位相关基因prohibitin(PHB)，抑制人脂肪源多潜能干细胞和小鼠前脂肪细胞向成脂方向的分化和脂滴形成[45-48]；在山羊乳腺上皮细胞中也发现，miR-27a降低不饱和/饱和脂肪酸比例、下调脂肪合成相关基因(PPARγ、SCD和DGAT1)的表达、抑制甘油三酯积累[49]；miR-143靶向结合pleiotrophin(PTN)基因的编码区从而促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的分化和脂肪聚积[50]；大鼠脂肪源基质细胞的生长抑制阶段或终末分化阶段异位表达miR-143促进脂肪形成，miR-143的这种调控作用是通过直接靶向MAPK2K5，抑制MAP2K5-ERK5信号通路实现的[21]。

4.5 miR-145

前期研究发现，miR-145在240日龄荣昌大猪背脂中的表达量显著高于7日龄荣昌仔猪[24]；随着小鼠前脂肪细胞[51]、猪肌内血管干细胞(IVSC)和皮下血管干细胞(SVSC)[36]的成脂分化，miR-145的表达量显著上调，表明miR-145可能调控脂肪细胞发育和脂肪形成。随后Y.Guo等[52]首先利用“天花板”法培养猪的去分化前脂肪细胞(DFAT)，再将转染ssc-miR-145慢病毒载体的DFAT细胞进行诱导分化，观察miR-145对DFAT细胞成脂分化程度的影响。结果表明，随着DFAT细胞的分化，miR-145的表达量逐渐升高。脂肪细胞分化过程中上调表达的miRNA可促进脂肪形成。此研究发现，过表达miR-145抑制成脂关键基因(C/EBPα和PPARγ2)的表达和脂滴积累，蛋白印迹和荧光素酶试验证明胰岛素信号通路关键基因IRS1是miR-145的直接靶标，miR-145可能通过靶向IRS1基因阻断胰岛素信号通路对成脂的促进作用。

4.6 miR-181

前期研究显示，miR-181在小鼠前脂肪细胞分化过程中的表达量显著升高[51]；在高脂日粮饲喂的牛背部皮下和肾周脂肪组织中，miR-181的表达量显著下调，暗示miR-181可能调控脂肪形成[41]。随后H.Li等[53]对miR-181调控猪脂肪细胞发育的功能进行研究。结果显示，超表达miR-181上调猪前脂肪细胞中脂肪合成相关基因(PDE3B、LPL、PPARγ、GLUT1、GLUT4、adiponectin和FAS)的表达、加速脂滴积累、增加甘油三酯含量；且TNF-α是miR-181的靶基因，过表达TNF-α能够拮抗miR-181的促成脂作用。因此，笔者认为miR-181通过靶向TNF-α基因，调控下游脂肪相关基因的表达，进而参与调控脂肪形成。

4.7 miR-33b

最新的研究结果显示[54]，miR-33b靶向成脂激活因子EBF1，抑制脂肪标记基因(C/EBPα、PPARγ、ap2、CD36、adiponectin、SCD1和FAS)的表达，推迟猪前脂肪细胞的成脂分化，抑制甘油三酯的生成和脂滴积累[54]。此外，研究者以5月龄瘦肉型长×(杜长大)和脂肪型梅山×(杜长大)杂交母猪为研究对象，对背膘厚、血液甘油三酯含量和皮下脂肪组织中的miR-33b、成脂基因的表达水平进行测定。结果表明，miR-33b在瘦肉型杂交猪中高表达，其他测定基因则在脂肪型杂交猪中高表达，这也间接支持了miR-33b抑制脂肪形成这一研究结果。然而，在猪前脂肪细胞分化过程中和瘦肉型、脂肪型杂交猪皮下脂肪组织中，miR-33b宿主基因SREBF1的表达几乎没有差异，这与miR-33b的表达趋势不一致，也与人中的研究结果截然不同[55]，这可能与研究的物种和组织的不同有关。研究也已证实，miR-33a/b协同宿主基因SREBP共同调控胆固醇输出及转运、脂肪酸代谢和胰岛素信号通路[56-57]。此外，作者还发现，猪C/EBPα和PPARγ基因的启动子区域存在转录因子EBF1的结合位点，然而转录因子EBF1是否结合并调控C/EBPα和PPARγ基因的转录以及miR-33b是否调控猪胆固醇代谢仍值得深入研究。

4.8 miR-199a-5p

X.E.Shi等[58]发现，miR-199a-5p在猪皮下脂肪组织中的表达量远远高于心、肝、脾、肺、肾和肌肉，且其在猪前体脂肪细胞分化过程中呈现先下降后上升的趋势，这与小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化过程中miR-199a-5p的表达模式是一致的[59]。另外，miR-199-5p在7日龄荣昌仔猪背部脂肪组织中的表达量显著高于240日龄荣昌大猪[24]。这些都表明，miR-199a-5p可能在猪皮下脂肪组织中发挥功能。进一步的研究显示，miR-199a-5p促进猪前体脂肪细胞的增殖，抑制成脂标记基因(PPARγ、ap2、perilipinA、LPL和FAS)的表达和脂滴的积累。miR-199a-5p的这种生理功能可能是通过靶向Cav1介导调控PI3K/Akt通路和脂滴的转运、贮存来实现的[58]。此外，在人骨髓源间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中，miR-199a的表达量显著下调，在干细胞中过表达miR-199a可以抑制成脂标记基因FABP4的表达[60]，这与miR-199a-5p在猪中的研究结果相符。

4.9 miR-130b和miR-374b

早在2010年，E.K.Lee等[61]对miR-130在人和小鼠前脂肪细胞中的功能进行了系统研究。试验证明，miR-130a/b靶向成脂关键基因PPARγ，抑制leptin、adiponectin、LPL和FABP4等脂肪标记基因的表达，从而阻碍脂肪细胞分化和甘油三酯积累。直到2013年，科研人员首次在猪中对miR-130调控脂肪的形成进行功能研究。S.Pan等[62]利用低蛋白日粮饲喂妊娠期和哺乳期梅山母猪来研究miRNAs对后代仔猪脂质代谢的影响。结果表明，低蛋白日粮组断奶仔猪的体重和背膘厚显著低于标准蛋白日粮组，背脂中miR-130b和miR-374b的表达量显著高于标准蛋白日粮组，且miR-130b和miR-374b分别靶向抑制PPARγ和C/EBPβ基因的表达。随后该学者又将miR-130b包装进入微泡，并用此微泡处理猪前脂肪细胞(即受体细胞)，同时进行成脂诱导分化。结果发现，受体细胞能够超表达miR-130b；miR-130b通过靶向PPARγ下调脂肪形成基因(FAS、perilipin、FTO和GR)的表达、促进脂解基因(HSL)的表达，从而抑制猪脂肪细胞中甘油三酯形成[63]，这为治疗糖尿病的临床应用提供了新的方法和思路。

2013年，S.Pan课题组的研究发现，地塞米松(DEX)促进猪前脂肪细胞PPARγ的表达和脂肪形成，且地塞米松处理的细胞中miR-374a和miR-374b的表达上调，而C/EBPβ基因的表达下调，进一步分析证实C/EBPβ为miR-374a/b的靶基因[64]，这与其另一项研究报道[62]相符。然而在其他物种中，miR-374调控脂肪形成的研究并未见报道，仅见miR-374表达差异的研究，如miR-374a/b在高脂日粮饲喂的牛背部皮下和肾周脂肪组织中的表达量显著上调[41]、miR-374b在人成熟脂肪细胞中的表达量显著降低[61]。因此，miR-374a/b对前脂肪细胞的成脂分化和脂肪形成的调控作用仍值得继续深入探讨。

5 猪脂肪相关miRNAs功能研究的不足与问题

由以上可以看出，近几年科学家们发现越来越多的miRNAs调控猪的脂肪形成及代谢，但是其功能研究仍存在许多不足之处：①大多脂肪相关miRNAs的功能研究在人或小鼠中已经报道，在猪中只是简单的重复；②只是研究miRNAs对脂肪细胞分化和脂肪形成的作用，并没有对其具体的调控机制进行深入分析，即只停留在“表象”，没有深入到“本质”；③即使对miRNAs的调控机制和作用靶基因进行论证，但试验设计并不严谨。人们知道同一miRNA可靶向作用多个靶标，只通过蛋白印迹和双荧光素酶试验并不能说明miRNA就是通过此基因来介导调控脂肪形成。如果再增加补偿试验(在超表达miRNA的基础上过表达靶基因)将会更有说服力。因此，与小鼠中相比，猪中脂肪相关miRNAs的功能研究并不彻底，仍值得继续深入研究。

另外，利用传统方法分离得到的猪脂肪基质微管中除含有前脂肪细胞外，还存在大量的血红细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞。此种方法获得的猪前脂肪细胞的纯度不高，需要经过其他方法去除这些杂细胞，程序繁杂，且不利于精细研究前脂肪细胞的分化机制。本课题组在实际操作过程中也发现分离的猪前脂肪细胞贴壁较少，增殖速度慢，易自分化形成脂滴，且消化传代后细胞易变形。这些都局限了猪前脂肪细胞分化和脂肪形成的研究，堪称猪脂肪相关miRNAs功能研究的“瓶颈”。而依靠“天花板”法建立的高纯度、高分化率、低成本的猪前脂肪细胞系或许可作为一种商品化的细胞系，为进一步揭示脂肪细胞分化和脂肪形成机制奠定基础。

6 展 望

猪的脂肪蓄积能力极强，比啮齿类动物更适合于哺乳动物脂肪组织发育的研究[13，65-66]，并且猪在亲缘关系上比小鼠更接近人类，在生理学、解剖学和病理学等方面与人类极其相似[67-68]。因此，猪逐渐成为生物和医学研究的重要模式生物。随着研究的不断深入，今后的研究重心势必将从猪miRNAs的挖掘鉴定转向其功能探索，进一步分析阐释miRNAs发挥作用的调控网络和信号通路。相信不久以后，miRNAs将在调控猪生长发育和改良肉质性状等方面具有突破性进展，同时也为肥胖和糖尿病等相关疾病的药物研发提供新的思路。

[1] KERSHAW E E，FLIER J S.Adipose tissue as an endocrine organ[J].JClinEndocrinolMetab，2004，89(6)：2548-2556.

[2] OLLER do NASCIMENTO C M，RIBEIRO E B，OYAMA L M.Metabolism and secretory function of white adipose tissue：effect of dietary fat[J].AnAcadBrasCienc，2009，81(3)：453-466.

[3] LEFTEROVA M I，LAZAR M A.New developments in adipogenesis[J].TrendsEndocrinolMetab，2009，20(3)：107-114.

[4] WHITE U A，STEPHENS J M.Transcriptional factors that promote formation of white adipose tissue[J].MolCellEndocrinol，2010，318(1-2)：10-14.

[5] LOWE C E，O′RAHILLY S，ROCHFORD J J.Adipogenesis at a glance[J].JCellSci，2011，124(Pt16)：2681-2686.

[6] BUSHATI N，COHEN S M.microRNA functions[J].AnnuRevCellDevBiol，2007，23：175-205.

[7] LEE R C，FEINBAUM R L，AMBROS V.TheC.elegansheterochronic genelin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity tolin-14[J].Cell，1993，75(5)：843-854.

[8] REINHART B J，SLACK F J，BASSON M，et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing inCaenorhabditiselegans[J].Nature，2000，403(6772)：901-906.

[9] MCGREGOR R A，CHOI M S.microRNAs in the regulation of adipogenesis and obesity[J].CurrMolMed，2011，11(4)：304-316.

[10] DOENCH J G，PETERSEN C P，SHARP P A.siRNAs can function as miRNAs[J].GenesDev，2003，17(4)：438-442.

[11] LYTLE J R，YARIO T A，STEITZ J A.Target miRNAs are repressed as efficiently by microRNA-binding sites in the 5′ UTR as in the 3′ UTR[J].ProcNatlAcadSciUSA，2007，104(23)：9667-9672.

[12] TAY Y，ZHANG J，THOMSON A M，et al.MicroRNAs toNanog，Oct4 andSox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation[J].Nature，2008，455(7216)：1124-1128.

[13] WERNERSSON R，SCHIERUP M H，JØRGENSEN F G，et al.Pigs in sequence space：a 0.66X coverage pig genome survey based on shotgun sequencing[J].BMCGenomics，2005，6：70.

[14] KIM H J，CUI X，KIM E J，et al.New porcine microRNA genes found by homology search[J].Genome，2006，49(10)：1283-1286.

[15] KIM J，CHO I S，HONG J S，et al.Identification and characterization of new microRNAs from pigs[J].MammGenome，2008，19(7-8)：570-580.

[16] CHO I S，KIM J，SEO H Y，et al.Cloning and characterization of microRNAs from porcine skeletal muscle and adipose tissue[J].MolBiolRep，2010，37(7)：3567-3574.

[17] REDDY A M，ZHENG Y，JAGADEESWARAN G，et al.Cloning，characterization and expression analysis of porcine microRNAs[J].BMCGenomics，2009，10：65.doi：10.1186/1471-2164-10-65.

[18] XIE S S，LI X Y，LIU T，et al.Discovery of procine microRNAs in multiple tissues by a Solexa deep sequencing approach[J].PLoSOne，2011，6(1)：e16235.

[19] ESAU C，KANG X，PERALTA E，et al.MicroRNA-143 regualtes adipocyte differentiation[J].JBiolChem，2004，279(50)：52361-52365.

[20] WANG T，LI M，GUAN J，et al.MicroRNAs miR-27a and miR-143 regulate porcine adipocyte lipid metabolism[J].IntJMolSci，2011，12(11)：7950-7959.

[21] CHEN L，HOU J，YE L，et al.MicroRNA-143 regulates adipogenesis by modulating the MAP2K5-ERK5 signaling[J].SciRep，2014，4：3819.doi：10.1038/srep03819.

[22] SUN T，FU M，BOOKOUT A L，et al.MicroRNA let-7 regulates 3T3-L1 adipogenesis[J].MolEndocrinol，2009，23(6)：925-931.

[23] CHEN C，AI H，REN J，et al.A global view of porcine transcriptome in three tissues from a full-sib pair with extreme phenotypes in growth and fat deposition by paired-end RNA sequencing[J].BMCGenomics，2011，12：448.doi：10.1186/1471-2164-12-448.

[24] LI G，LI Y，LI X，et al.MicroRNA identity and abundance in developing swine adipose tissue as determined by Solexa sequencing[J].JCellBiochem，2011，112(5)：1318-1328.

[25] ESAU C，DAVIS S，MURRAY S F，et al.miR-122 regulation of lipid metabolism revealed byinvivoantisense targeting[J].CellMetab，2006，3(2)：87-98.

[26] CIRERA S，BIRCK M，BUSK P K，et al.Expression profiles of miRNA-122 and its targetCAT1 in minipigs(Susscrofa) fed a high-cholesterol diet[J].CompMed，2010，60(2)：136-141.

[27] LI G，WU Z，LI X，et al.Biological role of microRNA-103 based on expression profile and target genes analysis in pigs[J].MolBiolRep，2011，38(7)：4777-4786.

[28] PENG Y，XIANG H，CHEN C，et al.MiR-224 impairs adipocyte early differentiation and regulates fatty acid metabolism[J].IntJBiochemCellBiol，2013，45(8)：1585-1593.

[29] CHEN C，DENG B，QIAO M，et al.Solexa sequencing identification of conserved and novel microRNAs in backfat of Large White and Chinese Meishan pigs[J].PLoSOne，2012，7(2)：e31426.

[30] CHEN C，PENG Y，PENG Y，et al.miR-135a-5p inhibits 3T3-L1 adipogenesis through activation of canonical Wnt/β-catenin signaling[J].JMolEndocrinol，2014，52(3)：311-320.

[31] CHEN C，XIANG H，PENG Y L，et al.Mature miR-183，negatively regulated by transcription factor GATA3，promotes 3T3-L1 adipogenesis through inhibition of the canonical Wnt/β-catenin signaling pathway by targetingLRP6[J].CellSignal，2014，26(6)：1155-1165.

[32] FERNANDEZ X，MONIN G，TALMANT A，et al.Influence of intramuscular fat content on the quality of pig meat-1.Composition of the lipid fraction and sensory characteristics of m.longissimus lumborum[J].MeatSci，1999，53(1)：59-65.

[33] VAN LAACK R L，STEVENS S G，STALDER K J.The influence of ultimate pH and intramuscular fat content on pork tenderness and tenderization[J].JAnimSci，2001，79(2)：392-397.

[34] GARDAN D，GONDRET F，LOUVEAU I.Lipid metabolism and secretory function of porcine intramuscular adipocytes compared with subcutaneous and perirenal adipocytes[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab，2006，291(2)：E372-E380.

[35] ZHOU X，LI D，YIN J，et al.CLA differently regulates adipogenesis in stromal vascular cells from porcine subcutaneous adipose and skeletal muscle[J].JLipidRes，2007，48(8)：1701-1709.

[36] GUO Y，MO D，ZHANG Y，et al.MicroRNAome comparison between intramuscular and subcutaneous vascular stem cell adipogenesis[J].PLoSOne，2012，7(9)：e45410.

[37] XU P，VERNOOY S Y，GUO M，et al.TheDrosophilamicroRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism[J].CurrBiol，2003，13(9)：790-795.

[38] KRÜTZFELDT J，RAJEWSKY N，BRAICH R，et al.Silencing of microRNAsinvivowith ‘antagomirs’[J].Nature，2005，438(7068)：685-689.

[39] ILIOPOULOS D，DROSATOS K，HIYAMA Y，et al.MicroRNA-370 controls the expression of microRNA-122 andCpt1αand affects lipid metabolism[J].JLipidRes，2010，51(6)：1513-1523.

[40] 宁小敏．miR-196a对猪前脂肪细胞增殖分化的影响[D]．杨凌：西北农林科技大学，2010． NING X M.Effects of miR-196a on porcine adipocyte proliferation and differentiation[D].Yangling：Northwest Agriculture & Forestry University，2010.(in Chinese)

[41] ROMAO J M，JIN W，HE M，et al.Altered microRNA expression in bovine subcutaneous and visceral adipose tissue from cattle under different diet[J].PLoSOne，2012，7(7)：e40605.

[42] SURYAWAN A，HU C Y.Effect of retinoic acid on differentiation of cultured pig preadipocytes[J].JAnimSci，1997，75(1)：112-117.

[43] BRANDEBOURG T D，HU C Y.Regulation of differentiating pig preadipocytes by retinoic acid[J].JAnimSci，2005，83(1)：98-107.

[44] 李美航，仇 杨，刘 帅，等．过表达miR-103促进猪前体脂肪细胞分化[J]．生物工程学报，2012，28(8)：927-936． LI M H，QIU Y，LIU S，et al.Over-expressed miR-103 promotes porcine adipocyte differentiation[J].ChineseJournalofBiotechnology，2012，28(8)：927-936.(in Chinese)

[45] KARBIENER M，FISCHER C，NOWITSCH S，et al.microRNA miR-27b impairs human adipocyte differentiation and targetsPPARγ[J].BiochemBiophysResCommun，2009，390(2)：247-251.

[46] LIN Q，GAO Z，ALARCON R M，et al.A role of miR-27 in the regulation of adipogenesis[J].FEBSJ，2009，276(8)：2348-2358.

[47] KIM S Y，KIM A Y，LEE H W，et al.miR-27a is a negative regulator of adipocyte differentiation via suppressingPPARγexpression[J].BiochemBiophysResCommun，2010，392(3)：323-328.

[48] KANG T，LU W，XU W，et al.MicroRNA-27(miR-27) targetsprohibitinand impairs adipocyte differentiation and mitochondrial function in human adipose-derived stem cells[J].JBiolChem，2013，288(48)：34394-34402.

[49] LIN X，LUO J，ZHANG L P，et al.MiR-27a suppresses triglyceride accumulation and affects gene mRNA expression associated with fat metabolism in dairy goat mammary gland epithelial cells[J].Gene，2013，521(1)：15-23.

[50] YI C，XIE W D，LI F，et al.MiR-143 enhances adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells through targeting the coding region of mousepleiotrophin[J].FEBSLett，2011，585(20)：3303-3309.

[51] KELLER P，GBURCIK V，PETROVIC N，et al.Gene-chip studies of adipogenesis-regulated microRNAs in mouse primary adipocytes and human obesity[J].BMCEndocrDisord，2011，11：7.

[52] GUO Y，CHEN Y，ZHANG Y，et al.Up-regulated miR-145 expression inhibits porcine preadipocyte differentiation by targetingIRS1[J].IntJBiolSci，2012，8(10)：1408-1417.

[53] LI H，CHEN X，GUAN L，et al.MiRNA-181a regulates adipogenesis by targetingtumornecrosisfactor-α(TNF-α) in the porcine model[J].PLoSOne，2013，8(10)：e71568.

[54] TANIGUCHI M，NAKAJIMA I，CHIKUNI K，et al.MicroRNA-33b downregulates the differentiation and development of porcine preadipocytes[J].MolBiolRep，2014，41(2)：1081-1090.

[55] NAJAFI-SHOUSHTARI S H，KRISTO F，LI Y，et al.MicroRNA-33 and theSREBPhost genes cooperate to control cholesterol homeostasis[J].Science，2010，328(5985)：1566-1569.

[56] MARQUART T J，ALLEN R M，ORY D S，et al.miR-33 linksSREBP-2 induction to repression of sterol transporters[J].ProcNatlAcadSciUSA，2010，107(27)：12228-12232.

[58] SHI X E，LI Y F，JIA L，et al.MicroRNA-199a-5p affects porcine preadipocyte proliferation and differentiation[J].IntJMolSci，2014，15(5)：8526-8538.

[59] KAJIMOTO K，NARABA H，IWAI N.MicroRNA and 3T3-L1 pre-adipocyte differentiation[J].RNA，2006，12(9)：1626-1632.

[60] LAINE S K，ALM J J，VIRTANEN S P，et al.MicroRNAs miR-96，miR-124，and miR-199a regulate gene expression in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].JCellBiochem，2012，113(8)：2687-2695.

[61] LEE E K，LEE M J，ABDELMOHSEN K，et al.miR-130 suppresses adipogenesis by inhibiting peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression[J].MolCellBiol，2011，31(4)：626-638.

[62] PAN S，ZHENG Y，ZHAO R，et al.MicroRNA-130b and microRNA-374b mediate the effect of materal dietary protein on offspring lipid metabolism in Meishan pigs[J].BrJNutr，2013，109(10)：1731-1738.

[63] PAN S，YANG X，JIA Y，et al.Microvesicle-shuttled miR-130b reduces fat deposition in recipient primary cultured porcine adipocytes by inhibitingPPAR-γexpression[J].JCellPhysiol，2014，229(5)：631-639.

[64] PAN S，ZHENG Y，ZHAO R，et al.miRNA-374 regulates dexamethasone-induced differentiation of primary cultures of porcine adipocytes[J].HormMetabRes，2013，45(7)：518-525.

[65] LARSEN M O，ROLIN B.Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes，with special focus on type 1 diabetes research[J].ILARJ，2004，45(3)：303-313.

[66] BELLINGER D A，MERRICKS E P，NICHOLS T C.Swine models of type 2 diabetes mellitus：insulin resistance，glucose tolerance，and cardiovascular complications[J].ILARJ，2006，47(3)：243-258.

[67] LUNNEY J K.Advances in swine biomedical model genomics[J].IntJBiolSci，2007，3(3)：179-184.

[68] GORODKIN J，CIRERA S，HEDEGAARD J，et al.Porcine transcriptome analysis based on 97 non-normalized cDNA libraries and assembly of 1，021，891 expressed sequence tags[J].GenomeBiol，2007，8(4)：R45.

(编辑 郭云雁)

Progress on the Research of miRNAs Associated with Fat Development in Pigs

CHEN Chen*，HU Xiong-gui，ZHU Ji，REN Hui-bo，DENG Yuan，PENG Ying-lin*

(HunanInstituteofAnimalandVeterinaryScience，Changsha410131，China)

Adipose tissue，an important factor that affects the porcine carcass quality，is closely related with the pork quality.Understanding the regulation mechanisms of adipose tissue development and fat metabolism are important to the animal husbandry production and disease treatment.miRNAs(microRNAs) are a class of endogenous，non-coding，small RNA molecules，which are typically 18-24 nucleotides(nt) in length.miRNAs play an important role in the regulation of gene expression at the post-transcriptional level.A large number of evidences demonstrated that miRNAs have influence on diverse biological processes，such as preadipocyte differentiation，adipogenesis，fatty acid metabolism and cholesterol biosynthesis.However，only 326 porcine miRNAs has been currently reported and rare studies could be read about the porcine miRNAs that regulate the fat development.Herein，it is reviewed that the studies on the discovery and identification of fat-associated miRNAs in pigs in this paper，and the progress on the research of porcine miRNAs that regulate fat development are also summarized.

pig；fat development；miRNAs；regulation mechanism

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.001

2014-06-09

国家自然科学基金(31401097)；湖南省科技计划项目(2014NK3036)

陈 晨(1986-)，男，河南开封人，助理研究员，博士，主要从事猪分子遗传育种的研究，Tel：0731-84611058

*通信作者：陈 晨，助理研究员，E-mail：2004chch@163.com；彭英林，研究员，E-mail：ylpeng_1965@163.com

S828；S813.3

A

0366-6964(2015)12-2117-10