miRNAs对神经元发育、功能及神经退行性疾病的影响*

徐宏博，王勇军

（1南通大学医学院，南通226001；2南通大学神经再生重点实验室）

·再生医学·

miRNAs对神经元发育、功能及神经退行性疾病的影响*

徐宏博1，王勇军2**

（1南通大学医学院，南通226001；2南通大学神经再生重点实验室）

生物体内的microRNA（miRNA）具有广泛性和多样性，通过调控转录后的基因表达参与调节生物体的多种生理功能。在神经系统中，miRNAs对神经元的发育及其功能，进而对阿尔兹海默病，帕金森病，亨廷顿病以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症等神经退行性疾病的发生和发展发挥着非常重要的作用。本文对miRNAs通过作用于靶基因调节干细胞的分化、神经元的形态发生和功能以及神经退行性疾病等进行综述。

神经元；单链小分子RNAs；神经退行性疾病；阿尔兹海默病；帕金森病；亨廷顿病；肌萎缩性脊髓侧索硬化症

microRNA（miRNA）是一类真核生物中广泛存在的内源性非编码单链小分子RNA，长度为20～24个核苷酸。成熟miRNA通过与靶基因的3’端非编码区（3’UTR）互补结合，导致mRNA翻译受到抑制从而调控转录后的基因表达[1]。miRNAs参与调节生物体的多种生理功能，包括生长发育、细胞增殖分化、疾病发生发展等。越来越多的研究表明miRNAs在大脑神经组织中表达丰富，呈现明显的发育时间和组织空间特异性。miRNAs调节神经元的发育、轴突的形成、突触连接，从而调控神经系统的发育和功能[2-7]。miRNAs表达量发生改变或其靶基因发生突变，则可能引起相应表型变化，引发神经退行性疾病的发生和发展[7]。本文对miRNAs调节神经元发育、功能及其神经退行性疾病的发生和发展进行综述。

1 miRNAs与神经干细胞的增殖分化

在大脑神经系统发育过程中，神经干细胞不断增殖分化，形成神经元和胶质细胞构成神经系统并发挥功能。现已发现多种miRNAs对于神经干细胞的增殖和分化有影响。发现miR-184在哺乳动物脑内室下区和齿状回的神经干细胞中高表达。甲基化CpG结合蛋白1（MBD1）是一种转录调控蛋白，能够直接抑制miR-184的表达。一旦MBD1缺失，高表达的miR-184会促进神经干细胞增殖而抑制其分化。Numbl蛋白对于胚胎神经干细胞功能和大脑皮质发展有着重要作用。研究发现，Numbl为miR-184的下游调控靶蛋白，在MBD1缺失或miR-184高表达情况下，外源性表达的Numbl可逆转神经干细胞的增殖和分化失常[8]。因而推测MBD1，miR-184和Numbl之间存在调控网络，共同维持神经干细胞增殖和分化平衡。

let-7家族的miRNAs在系统进化上高度保守。研究表明，这类miRNAs与神经干细胞的自我更新和分化有关。过表达let-7a能够促进神经干细胞的分化，而抑制其表达则能维持神经干细胞的自我更新。此外TRIM-NHL蛋白TRIM32通过结合Argonaute-1（Ago1）蛋白增强let-7a促进神经干细胞分化的功能[2]。let-7b是该家族另一个成员，能够通过调节Hmga2、cyclin D1和TLX等靶基因，控制神经干细胞的分化[3]。

miR-9和miR-124在神经干细胞增殖分化过程中发挥重要作用，这也是目前研究最多的2种miRNAs。miR-9是在动植物进化演变过程中高度保守的一类miRNA，在脊椎动物中枢神经系统发育过程中高表达。通过不同脊椎动物发育过程的功能分析，证实miR-9对胚胎神经干细胞的增殖和分化起着重要作用。miR-9通过抑制Hes1、REST、FoxG1和Zic5等转录调节因子促进神经干细胞的分化，而通过抑制Elav等促进干细胞的增殖。miR-9作用靶基因的研究发现存在反馈环路，这些靶基因能够反馈性调节miR-9的表达量，从而协调平衡胚胎发育过程中神经干细胞的增殖和分化[4]。

脑发育过程中也特异性高表达miR-124。当神经细胞处于非发育阶段时，神经元限制性沉默因子（REST）可沉默miR-124启动子基因从而抑制转录发生。当神经干细胞分化时，REST表达下调，miR-124表达增加。Makeyev等[9]发现miR-124通过触发大脑特异性的选择性前体mRNA剪接，促进神经元分化。RNA结合蛋白PTBP1是一种在大脑非神经细胞中广泛存在的选择性前体mRNA剪接抑制因子。在神经元分化过程中，miR-124抑制PTBP1基因的表达，从而激活前体mRNA的选择性剪接，使神经干细胞进入神经元分化过程。已证明miR-124在脑发育阶段能够调控超过100个靶基因。目前为止，已知miR-124能够作用于Sox9、Jag1、SCP1和Ephrin-B1等一系列调控因子来促进脑神经分化。

Yoo等[10]发现在神经发育过程中，miR-9和miR-124共同参与神经干细胞染色质重塑复合物组分的调节。BAF53a和BAF53b为神经干细胞特异性BAF复合物的两个亚基。BAF53a是神经干细胞增殖所必须的，并在分化的神经元中表达下降，而BAF53b则与树突形成密切相关。在神经干细胞分化过程中，miR-9和miR-124共同抑制BAF53a，促进BAF53b的表达。而在神经干细胞增殖过程中，REST抑制miR-9和miR-124的表达，BAF53a表达增加并抑制BAF53b的表达。

2 miRNAs调节神经元的形态发生与功能

miRNAs不仅与神经干细胞的增殖分化有着密切关系，而且对于神经元形态的维持和功能的发挥有着重要作用。Schaefer等[11]运用浦肯野细胞作为模型进行研究，通过Dicer酶的失活干预miRNAs表达，发现浦肯野细胞的电生理特征和动物的运动协调能力在短期内无明显影响。但2～3个月的持续低表达miRNAs会导致浦肯野细胞的死亡和共济失调。Babiarz等[5]通过敲除miRNAs合成相关的Dgcr8蛋白，进一步确认miRNAs对于成熟神经元存活和功能具有重要的调节作用。

神经元通过树突接收外界信息传递给细胞本体并通过轴突传出信息，轴突与树突形态与功能的稳定直接关系到神经元功能的正常发挥。miR-132可下调p250GAP，从而控制树突的生长；miR-134和miR-138则通过抑制LIMK1和APT1的表达影响树突生长[6]。神经元要正确传出信息需要调整轴突的正确导向，在线虫C.elegans的前腹微管神经元轴突中，lin-4的靶基因LIN-14通过作用于UNC-40受体，促进UNC-6介导的轴突向腹侧吸引[12]。miR-124通过抑制靶蛋白CoREST的表达，促进NPR-1在视网膜神经节细胞中的表达，来维持神经元轴突的正确导向[13]。

3 miRNAs与神经退行性疾病

神经退行性疾病是由脑和脊髓中神经元结构或功能损伤所引起的。主要包括阿尔兹海默病（AD），帕金森病（PD），亨廷顿病（HD），肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）等，并且随着年龄增长而不断恶化。神经退行性疾病病理过程十分复杂，原因也多种多样。而近年来研究发现，miRNAs与神经退行性疾病的发生发展有着密切关系。

3.1 阿尔兹海默病 （AD） 阿尔兹海默病是一种持续性的神经功能障碍，其主要的病理特征是脑组织中Aβ蛋白沉积、神经纤维缠结形成和弥漫性大脑皮质萎缩。Aβ由淀粉样前体蛋白（APP）通过β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌复合物顺序裂解而成。神经纤维缠结则由过度磷酸化的Tau蛋白异常聚集而成。临床和实验结果表明，异常表达的miRNAs与AD的发生发展有着密切关系。BACE1、类胰岛素生长因子（IGF-1）、丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）都可以影响APP的表达，而这些调控蛋白又都受到相应的miRNAs调节。在体外实验中，Hebert等[14]发现下调miR-29a、miR-29b-1或miR-9可以抑制BACE1的表达。Hu等[15]对大鼠AD模型研究发现，miR-98表达水平与IGF-1呈负相关，过表达miR-98会下调IGF-1的表达，增加Aβ产生和Tau蛋白的磷酸化。在AD患者脑中，SPT表达量受一些miRNAs的调节，包括miR-137、miR-181c、miR-9和miR-15等[16]。另外，miRNAs还参与APP mRNA的选择性剪切。人类APP存在APP751、APP770和APP695）3种亚型，其中含有外显子7和8的亚型在AD患者中含量较多。miR-124在AD患者中表达水平较低。Smith等[7]在脑神经瘤细胞中，经过表达miR-124来抑制其靶基因PTB1，发现APP外显子7和8的剪切受到影响，进而影响Aβ的产生和聚集。

选择性敲除小鼠神经元Dicer基因，除了可引起大脑细胞凋亡，体积缩小，神经炎症等，还可以导致Tau蛋白的异常磷酸化。在AD中，Tau蛋白过度磷酸化并在神经元包浆中异常积聚，即形成神经纤维缠结。通过人类Tau mRNA 3’UTR在调控Tau表达方面的研究，运用不同的预测算法，Dickson等[17]发现miR-34a能够直接抑制Tau蛋白表达。另外，如何控制Tau蛋白的过度磷酸化也是减少神经纤维缠结形成的关键。Absalon等[18]发现，miR-26b在早期AD患者黑质表达上升，并且在疾病发展过程中持续高表达。在体外实验中，过表达miR-26b能够激活周期蛋白依赖性激酶5，且能加强Tau蛋白的磷酸化，并伴随细胞凋亡和退行性改变。因而，可以认为基于抑制miR-26的治疗方法不仅可以降低Tau蛋白磷酸化水平，减少神经纤维缠结形成，也许还加强神经元生存，发挥miRNA神经保护作用。

3.2 miRNAs与帕金森病（PD） 帕金森病又称震颤麻痹，是一种慢性中枢系统退化性失调。主要临床表现为局限于身体一侧的肢体静止性震颤，伴随症状包括运动迟缓、肌强直及姿势步态不稳。这些症状的出现是由于大脑黑质纹状体致密部多巴胺能神经元（DN）的不断丢失，导致多巴胺含量的显著下降。目前已发现一些miRNAs的分布和功能与帕金森病相关，为治疗帕金森病提供了可能的药物靶点。

miR-133b在中脑DN中特异性表达，而在失去DN的PD患者的中脑组织中缺乏miR-133b的表达。研究发现，miR-133b通过调节Pitx3的表达来调控中脑DN的成熟及其功能的发挥。Pitx3特异性诱导miR-133b的转录，而miR-133b反过来又可抑制Pitx3的活性。通过PD小鼠模型实验发现，miR-133b缺失会增加DN标志物的表达和去极化诱导的多巴胺释放，而miR-133b过表达则会抑制DN神经元分化并导致多巴胺释放显著减少。miR-133b与Pitx3形成一个负反馈环，调节DN的发育及功能[19]。

α-突触核蛋白（SNCA）是广泛存在于大脑突触前末梢的一种蛋白，PD患者大脑神经元中SNCA表达水平明显增高。异常聚集的SNCA及其突变体组成路易小体（Lewy bodies），可以作为诊断帕金森病的特征性标志物。已证实miR-7和miR-153可抑制SNCA的表达水平。Junn等[20]发现miR-7与SNCA的mRNA 3’UTR结合，抑制SNCA的表达，从而保护细胞对抗SNCA诱导所产生的蛋白酶抑制及毒性。Doxakis等[21]发现miR-7和miR-153共同参与SNCA的转录后调节，三者在神经元中协同表达，通过形成反馈回路来共同调节SNCA的表达。

富含亮氨酸的重复段激酶-2（LRRK-2）在大脑和纹状体中分布广泛。在PD动物模型中上调LRRK-2表达水平可加速神经元变性[22]，认为LRRK-2基因位点是一个可能引起帕金森病的遗传危险因素。Gehrke等[23]在发生LRRK-2突变的果蝇中发现，突变LRRK-2与Ago1和Ago2作用，干扰RISC形成，从而导致miRNAs介导的基因表达受到抑制。进一步研究发现miR-184和let-7可通过分别抑制转录因子E2F1和DP的表达来拮抗LRRK-2的蛋白抑制功能。

3.3 miRNA与亨廷顿病 亨廷顿病（HD）是一种由于亨廷顿基因中CAG三核苷酸重复序列过度扩展所引起的遗传性神经退行性疾病。发病时无法控制四肢，就像手舞足蹈一样，故又称亨廷顿舞蹈病。临床上主要表现为由于皮质和纹状体神经元进行性缺失所导致的认知障碍和舞蹈样动作。突变Htt在神经元轴突终末内形成聚集物，抑制突触小泡摄取与释放神经递质，影响其功能发挥。目前为止，有关亨廷顿基因功能的认识还比较少，但其突变形式已被证实可以影响细胞表型及其生存能力[24]。突变亨廷顿基因可以与Ago1和Ago2相互作用抑制处理小体形成[25]，这一过程可能与miRNAs有关。因而，研究人员试图通过调控miRNAs的表达来抑制亨廷顿基因突变，进而控制HD发生发展。

正常亨廷顿基因能与REST相作用，使其定位于神经元细胞质中，与众多的靶基因结合发挥正常作用。而突变亨廷顿基因使REST发生核转位，抑制其功能发挥[26]。Johnson等[27]根据REST结合位点，在人类基因组中确定了一系列受REST调控的miRNAs。其中在HD动物模型R6/2鼠大脑皮质中，miR-29a、miR-124a、miR-132和miR-330表达下降。随后研究发现，在HD患者样本中，只有miR-132表达下降，而miR-29a和miR-330表达升高，miR-124a表达差异不大。研究发现在HD患者大脑前额叶皮质中miR-196a-5p、miR-196b-5p、miR-615-3p特异性高表达[28]。这些miRNAs都位于Hox基因簇的基因间区中。对同一个样品行全mRNA测序，通过回归分析发现，亨廷顿CAG重复数、发病年龄和死亡年龄与这些miRNAs表达水平皆呈负相关。

3.4 miRNA与肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）肌萎缩性脊髓侧索硬化症又称渐冻人症，是一种渐进性和致命性的神经退行性疾病。病变主要累及脊髓前角，脑干，额叶皮质的运动神经元，导致肌肉组织逐渐衰弱、萎缩，最终麻痹丧失功能。随着对miRNAs认识的增多，认为miRNAs与ALS之间也存在联系，这为将来研究治疗ALS提供可能的靶点。

miR-206是一种特异性高表达于骨骼肌神经肌肉中的miRNA。Williams等[29]在SOD1转基因鼠下肢肌肉发现miR-206表达明显上升，并伴随相应神经症状。同时，切断坐骨神经也会引起miR-206表达上调，这可能与骨骼肌蛋白和肌细胞生成素有关。减少miR-206表达并不影响ALS的发生，但会加速疾病的发展，而过表达miR-206则可促进神经肌肉突触的增生而延缓ALS的发展。

TDP-43和FUS/TLS是2种多功能DNA/RNA结合蛋白，正常位于细胞核中，维持DNA和RNA正常水平，且参与miRNAs的合成与稳定。而在ALS患者中，细胞核中TDP-43和FUS/TLS这2种蛋白发生突变，在细胞质中异常积聚，限制其功能发挥[30-31]。Li等[32]证实TDP-43与脑中广泛存在的miR-9a联系，在ALS果蝇模型中，下调miR-9a表达水平能够使TDP-43表达缺失。

4 神经退行性疾病中miRNAs研究展望

众多研究证明，miRNAs与神经退行性疾病间存在密切关系，这为以特异性miRNAs作为药物靶点治疗神经退行性疾病提供可能。但到目前为止，仍然没有可以应用到临床的miRNA治疗方案。其原因：（1）miRNAs作为真核生物中广泛存在的内源性非编码小分子RNA，其作用方式十分复杂，同一靶位往往受多种miRNAs调控，还无法将miRNAs药物靶点具体化；（2）神经退行性疾病主要病变都发生在大脑神经元中，而通过药物注射或口服等方式进入治疗靶点就必须通过血脑屏障。如何顺利通过血脑屏障，而不丧失有效成分目前还没有很好的方法；（3）miRNAs通过结合靶mRNA 3’UTR调控基因表达，通过药物靶点抑制或过表达miRNA存在已知或未知的神经毒性作用，这点也是目前限制miRNAs治疗的原因之一。

虽然目前miRNAs治疗神经退行性疾病仍有各种限制，难以运用到临床，但其研究前景依然巨大。神经退行性疾病大多是渐进性疾病，有相当长的一段无症状期，早期难以及时发现再加上现阶段无根本性的治疗手段，因而早期诊断就显得尤为重要。而以miRNAs的特异性改变作为神经退行性疾病的生物诊断标记，则可能成为将来早期诊断的重要手段。当然这也需要研究人员的进一步深入研究。

总之，miRNAs研究热潮已经持续了很多年，对于miRNAs的了解也在不断加深，未来这种研究热潮仍将继续。研究miRNAs功能和调控机制对于了解神经退行性疾病发生、发展及治疗有着重要意义。

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R742.5

B

2015-04-27

1006-2440（2015）03-0213-05

国家自然科学基金资助项目（31471011）。*

*[通信作者]王勇军，E-mail：wyjbs@ntu.edu.cn