影响安徽省皖南地区结直肠癌患者预后的TGF-β 通路候选基因关联研究

沈丽娟，钟芳芳，吴平平，曹晓智，卢林明

0 引 言

结直肠癌作为严重威胁人类健康、影响患者生活质量的恶性肿瘤之一［1］，位列我国常见癌症第5位，5 年生存率为60%左右［2］。近些年来发病率持续攀升，临床上以手术结合术后化疗作为主要的治疗方式，技术较为成熟，即便如此，结直肠癌术后患者疾病复发率及死亡率仍然很高，预后情况不好。此外，临床上也发现，即使处于同样的疾病状态，给予相同治疗的一些患者，其预后也往往千差万别。国外研究表明，结直肠癌预后与一些遗传基因位点存在关联，提示遗传基因可能是影响结直肠癌患者的预后的因素之一［3-4］。

基因多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)广泛存在于人体的基因组中，是可以用来识别、定位与目标疾病相关的基因的第3 代遗传标记，近年来被广泛应用于肿瘤等疾病的研究中。大量SNP 位点已被证明与结直肠癌易感性相关(genome-wide association study，GWAS)，但关于预后的研究则较少。一项美国人群的研究结果显示，转化生长因子β 通路(TGF-β)上部分SNP 位点与结直肠癌预后显著相关，提示TGF-β 通路可能是影响结直肠癌预后的分子通路［5］，由于不同人种存在明显的遗传差异性，中国人群中是否能获得相同结论仍是未知，因此，本研究选取我国结直肠癌患者样本进行SNP 关联分析，以确定与我国结直肠癌患者预后相关的遗传位点，从而为根据不同遗传易感性的结直肠癌患者提供不同的治疗方案起到一定的指导作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 研究对象为安徽省芜湖市中医医院及皖南医学院附属医院2013 年1 月至2014 年4 月经病理检查确诊的I 期、Ⅱ期及Ⅲ期结直肠癌患者，排除家族性腺瘤息肉、遗传性息肉性结直肠癌及具有亲缘关系患者后，共有52 例纳入研究，其中男30 例，女22例，结肠癌22 例，直肠癌30 例，平均年龄(58.03±8.07)岁。肿瘤组织分化分级根据WHO 分类，癌组织中分化者37 例，中低分化等12 例，低分化者3 例;有淋巴转移16 例，无淋巴转移36 例。Ⅲ期结直肠癌患者带有关联位点rs10749971 的AC+AA 位点和rs961253 的CC 位点的为携带不利基因，如患者2 个位点都不是不利基因型的患者为低风险组，有1 个位点是不利基因型的患者为中等风险组，2 个位点都是不利基因型的患者为高风险组。全部患者随访期12 个月。

1.2 研究方法

1.2.1 研究位点筛选 选择以往研究证明的与结直肠腺癌预后相关的TGF-β 通路独立基因位点，并NCBI 的SNP 数据库查询(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)位点信息，选取其中在中国人群中最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)＞0.1、且分型成功的SNPs，最终共5 个SNPs 纳入研究，详见表1。

表1 纳入研究SNP 位点信息Table 1 SNPs locus information included in the study

1.2.2 研究指标及方法 收集患者年龄、性别、癌症分期、癌症分化程度、淋巴转移情况及癌症位置等信息。DNA 样本提取自患者癌组织蜡块切片，SNP分型采用美国应用生物系统公司的ABI7500 全自动荧光定量PCR 仪进行检测。具体方法:①标本处理:将全部入选患者的病理活检癌组织进行石蜡包埋后切片保存;②提取DNA:采用德国QIAGEN 石蜡组织DNA 提取试剂盒，柱提法提取DNA，具体步骤参考文献［6］;③SNP 分型方法:采用ABI7500 实时定量PCR 系统平台对提取的DNA 进行基因分型，采用TaqMan 探针实时定量荧光PCR 方法检测(ABI7500 实时定量荧光PCR 仪)基因分型结果。PCR 反应总体积10 μL，反应条件:95 ℃变性10 min，92 ℃15 s，60 ℃60 s，循环40 次。阴性对照模板为灭菌蒸馏水，双盲操作实验。结果由PCR 仪自动判读，各SNP 的PCR 分型聚类结果清晰，噪音较少。

1.3 统计学分析 采用SPSS 16.0 及SAS 9.2 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，2 组间均数的比较采用t 检验，多组间均数的比较采用方差分析;计数资料组间比较采用χ2或Fisher 确切概率法;单个SNP 对结直肠癌患者的复发率及生存率影响的风险比采用时协变量的Cox 回归分析。采用Haploview4.2 软件进行基因型的Hardy-Weinberg 平衡(HWE)检验。以P≤0.05 为有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 死亡患者较未死亡患者年龄偏大(P=0.005)，而复发与未复发患者的特征比较差异均无统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

表2 结直肠癌患者基本特征Table 2 Characteristics of 52 colorectal cancer patients

2.2 基因多态性与Ⅱ期及Ⅲ期结直肠癌复发的关联分析 遗传模型为隐形、加性模型时，POU2AF1 基因rs10749971 位点A 等位基因可显著增加Ⅲ期患者的复发风险(HR=1.968，P=0.004;HR=2.174，P=0.010);加性模型时，POU2AF1 基因rs10749971 位点A 等位基因可显著增加Ⅱ期患者的复发风险(HR=2.288，P=0.017);隐形遗传模型时，BMP2 基因rs961253 位点C 等位基因显著增加Ⅲ期患者的复发风险(HR=1.992，P=0.005)。见表3。

2.3 基因多态性与Ⅱ期及Ⅲ期结直肠癌生存关联分析 显性遗传模型时，SMAD7 基因rs4464148 位点A 等位基因降低Ⅱ期及Ⅲ期患者的死亡风险(HR=0.382，P=0.017;HR=0.230，P=0.006);而隐性遗传模型时，BMP2 基因rs961253 位点C 等位基因则可显著增加Ⅲ期患者死亡风险(HR=3.161，P=0.007)，见表4。

2.4 结直肠癌预后相关基因型的累积效应 Ⅲ期结直肠癌患者不利基因的累积效应与患者生存预后存在统计学关联(P=0.029)，低风险组至高风险组3 组的复发率分别为11.5%，20.0%及33.3%，组间差异无统计学意义(P=0.164)。3 组生存率分别为96.2%、45.0%、50%，组间差异具有统计学意义(P=0.029)，高风险组可显著增加患者的死亡风险(HR=15.512，95%CI=1.611 ～149.360)。30 个月之后，高风险组的生存率降至50%左右(P=0.004)。复发生存曲线存在交叉，引入时间协变量的模型评价结直肠癌相关基因型的累积效应对复发的影响，结果显示，加入时间交互项纳入模型后结直肠癌相关基因型的累积效应对结直肠癌复发的生存分析结果仍无统计学意义(P ＞0.05)。见表5，图1。

表3 TGF-β 通路SNPs 与结直肠癌患者复发情况相关分析Table 3 Correlation analysis of SNPs in TGF-β pathway and the recurrence risk of colorectal cancer patients

表4 TGF-β 通路SNPs 与结直肠癌患者生存情况相关分析Table 4 Correlation analysis of SNPs in TGF-β pathway and the survival of colorectal cancer patients

表5 累积不利基因型对Ⅲ期结直肠癌患者预后影响Table 5 Prognostic effects of cumulative adverse genotypes on Stage Ⅲcolorectal cancer patients

图1 不利基因型累积效应对Ⅲ期结直肠患者癌复发及死亡的生存曲线分析Figure 1 Survival curve analysis on the cumulative effects of adverse genotypes on the recurrence(A)and death(B)of Stage Ⅲcolorectal cancer patients

3 讨 论

关于结直肠癌预后相关基因的研究很少，由于遗传基因研究具有极为明显的种群特异性，因此在中国人群中的研究极为重要。TGF-β 通路因被认为与多种癌症的发生发展相关而颇受关注，一些大型全GWAS 研究及Meta 分析结果发现的多个与结直肠癌相关的SNP 位点皆位于TGF-β 通路上［7-13］，提示TGF-β 通路与结直肠癌易感性存在关联。基于该发现，Dai 等［5］在美国人群中开展的GWAS 研究首次发现TGF-β 通路上SNP 位点与结直肠癌预后显著相关，对结直肠癌预后遗传研究具有重大意义。然而，该结论是完全建立在美国人群样本上得出的，中国人群能获得相同结论仍有待进一步研究。因此本研究同样选取TGF-β 通路上SNP 位点，首次在中国人群中分析与结直肠癌的预后相关的SNP，以了解可能影响中国人群结直肠癌患者预后的遗传因素。由于结直肠癌Ⅱ期及Ⅲ期患者样本易于获得，且能满足长期随访要求，因此本研究仅选取了Ⅱ期及Ⅲ期结直肠癌患者。本研究结果显示，TGF-β 通路上POU2AF1 的SNP rs10749971 的A 等位基因可增加Ⅲ结直肠癌患者复发风险，与美国人群隐形遗传模型不同，本研究中该位点在加性模型下也显示与疾病预后相关。BMP2 基因SNP rs961253 的C 等位基因在隐性遗传模型下可同时增加Ⅲ期结直肠癌患者复发及死亡风险，SMAD7 基因SNP rs4464148 的A等位基因在显性模型下可降低Ⅲ期结直肠癌患者死亡风险，结果与美国人群研究一致［14］。本研究中未发现与Ⅱ期结直肠癌患者复发及死亡风险相关的位点，可能由于本研究样本量较小，检验效能不足以发现差异导致，也可能是由于之前的研究结果未进行校正，而本研究中所采用的Bonferroni 多重校正法过于保守导致。

本研究在中国人群中证明了位于TGF-β 通路的POU2AF1、BMP2 及SMAD7 基因SNP 位点与Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者预后显著相关，GREM1、BMP2 和SMAD7 皆是TGF-β 通路的信号分子，进一步证明了该通路可能在结直肠癌发生发展过程中起到重要作用［15］。TGF-β 家族主要包括转化生长因子-β 类(TGF-β)、骨形态发生蛋白类(BMPs)和激活素类，其中TGF-β 是一种极强的抑制正常上皮细胞、内皮细胞和造血细胞生长的细胞抑制剂。有生物学研究显示，在这些细胞中加入含TGF-β1 的培养基，可明显阻止细胞复制［16］。因此，在结直肠癌患病早期，TGF-β 可以通过抑制结肠上皮肿瘤细胞的生长并诱导其凋亡来抵御疾病的发展［13］。但随着肿瘤进展，TGF-β 诱导的生长抑制作用往往会减弱甚至丧失［17］。这种功能的丧失可能与通路上的信号分子相关基因突变相关。研究发现一些位于TGF-β 通路上的基因在结直肠癌发生时会出现明显的突变，使癌细胞对该通路的抑制作用不再敏感［18］。这些研究说明了TGF-β 通路基因突变与结直肠癌易感性相关的原因。此外，也有研究发现，TGFβ 家族的TGF-β1 含量与肿瘤术后复发率正相关［19］，提示TGF-β 通路基因突变对该通路功能的影响对结直肠癌预后也存在一定影响。BMPs 类属于TCF-β 超家族一员，研究发现BMP2 基因也参与结肠癌对机体的侵袭［20］。SNPs rs961253 距离BMP 基因很近，其突变可提示该基因的而变化。此外，SMAD7 基因双倍表达对结直肠癌患者预后不良存在影响［21］，本研究发现SMAD7 基因SNP 位点突变与结直肠癌预后相关，进一步暗示该基因与疾病的关联。然而，关于这些基因突变如何作用于代谢通路，进一步影响结直肠癌患者疾病发生发展，还需要从更多层面上开展生物功能实验研究予以确认。

肿瘤作为一种复杂性疾病，其发生发展收到多种遗传因素及环境因素的共同作用［22-23］，因此本研究首次在中国患者中进行了结直肠癌预后的SNP关联研究，采用多种遗传模型进行分析，结果较为全面可靠，具有一定意义。在生存分析过程中发现，不利基因型累积效应对Ⅲ期结直肠癌复发的Kaplan-Meier 曲线出现交叉，为使结果更加可靠，本研究采用了引入时间交互作用项的非比例Cox 风险模型进一步验证结果。然而，本研究基因位点选择相对少，可能影响疾病预后的环境因素未能充分得以考虑，以及遗传统计方法仍存在一定的局限性，因此仍需要更大样本量、更多基因位点的大型研究对结果予以进一步验证。

本研究采用候选基因方法，在中国人群中回顾性随访了Ⅱ期及Ⅲ期结直肠癌患者的预后情况，评价遗传基因SNP 与结直肠癌患者预后的关联。结果从一定程度上验证了前人的结果，也发现中国人群的不同之处，关于人群遗传基因的研究结果，仍需要生物功能实验进一步验证，为实现结直肠癌患者治疗个体化提供方向。

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