上海副猪嗜血杆菌分离鉴定及其耐药性分析

张 悦，李蓓蓓，魏建超，邵东华，刘 珂，石元元，邱亚峰，马志永

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

上海副猪嗜血杆菌分离鉴定及其耐药性分析

张 悦，李蓓蓓，魏建超，邵东华，刘 珂，石元元，邱亚峰，马志永

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

本研究旨在调查我国上海副猪嗜血杆菌对临床常用抗菌药的耐药情况，为该病的临床用药与防治提供数据支持。2013～2014年从上海市多个屠宰场采集样品以及送检病料共计484份，采用细菌分离培养及PCR的方法，分离鉴定出62株副猪嗜血杆菌。采用微量琼脂稀释法测定21种临床常用抗菌药的最小抑菌浓度。药物敏感性测定结果表明，所有菌株都对阿奇霉素、替米考星、泰妙菌素、阿米卡星、头孢噻呋和左氧氟沙星敏感，超过90%的菌株对红霉素（60， 96.8%）、氟苯尼考（59， 95.3%）、氯霉素（60， 96.8%）、庆大霉素（60， 96.8%）、壮观霉素（61， 98.4%）、青霉素（57， 91.9%）、氨苄青霉素（57， 91.9%）和环丙沙星（61， 98.4%）敏感，但对四环素和恩诺沙星耐药率较高，分别为75.8%（47）和30.6%（19）。耐药谱分析显示，37.1%的菌株对两种以上的抗菌药耐受。本研究结果显示上海市副猪嗜血杆菌对临床常用抗菌药物耐药总体状况尚不严重，但针对多个临床常用药物的耐药菌株已经出现，应对其耐药性进行长期监测。

副猪嗜血杆菌；抗菌药；耐药；猪

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis， Hps）在特定条件下侵入猪体而引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病，称革拉瑟氏病（Glässer's disease）［1］。近年来该病在集约化猪场内发病率呈明显上升趋势，主要引起从哺乳到保育的不同阶段仔猪死亡，生长发育不良，饲料利用率降低等问题［2］。通过使用疫苗可以控制副猪嗜血杆菌病，但是已有报道表明血清型多样性和大量无法分型的菌株对于交叉保护性疫苗的研制存在负面影响［1］。目前副猪嗜血杆菌病的防治主要依靠抗菌药治疗，但由于抗菌药长期盲目地使用，Hps对临床常用抗菌药已产生不同程度的耐药，耐药菌株的盛行给该病的治疗带来了极大挑战，所以临床上对其药物敏感性进行长期监控成为防治的关键。

国外对Hps的耐药性有大量研究，结果显示丹麦、英国、西班牙等国Hps的耐药性差异很大［3，4］，这可能与各国批准使用的抗生素的种类及抗生素的使用方式有关。2000年以来，中国国内关于猪场多发性浆膜炎和关节炎的报道陆续增多，特别是近几年急骤上升。在中国Hps临床分离株中，针对青霉素、氨苄青霉素、四环素、红霉素、庆大霉素、大观霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、恩诺沙星、泰妙菌素、耐萘啶酸和三甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑等临床常用药物的耐药菌株已经出现［5，6］。本研究对2013～2014年本实验室分离鉴定的Hps进行耐药性分析，为该病的临床用药与防治提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2013～2014年在上海市多个屠宰场，采集待宰猪（来源于上海市、江苏省、江西省、河南省、浙江省、安徽省的养殖场）的鼻拭子和病变肺组织，以及上海市及周边生猪养殖场送检病料，共计484份。

1.1.2 质控菌株 胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）ATCC27090购自美国典型培养物保藏中心。

1.1.3 主要试剂 胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白大豆肉汤（TSB）购自英国Oxoid公司；新生牛血清购自杭州四季青材料有限公司；辅酶I（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+）购自中国医药（集团）上海化学试剂公司；细菌基因组提取试剂盒和DNA Marker购自天根生化科技（北京）有限公司；药敏试验受试药物包括：克林霉素（Clindamycin，CLI）、阿奇霉素（Azithromycin，AZM）、红霉素（Erythromycin，ERY）、替米考星（Tilmicosin，TIL）、泰妙菌素（Tiamulin，TIA）、氟苯尼考（Florfenicol，FFC）、氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、四环素（Tetracycline，TET）、多西环素（Doxycycline，DOX）、庆大霉素（Gentamicin，GEN）、阿米卡星（Amikacin，AMK）、卡那霉素（Kanamycin，KAN）、安普霉素（Apramycin，APR）、壮观霉素（Spectinomycin，SPE）、头孢噻呋（Ceftiofur，CEF）、阿莫西林（Amoxicillin，AMX）、青霉素（Penicillin，PEN）、氨苄青霉素（Ampicillin，AMP）、左氧氟沙星（Levofloxacin，LEV）、恩诺沙星（Enrofloxacin，ENO）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）共21种药物，其中替米考星、泰妙菌素、氟苯尼考、安普霉素、头孢噻呋、恩诺沙星和多西环素购自中国兽医药品监察所；其余均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 从猪肺脏、鼻腔、脾脏、关节等组织器官中无菌取样，分别接种于含NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和5%小牛血清的TSA（胰蛋白大豆琼脂培养基）平板，5%CO2、37℃培养24～48h，观察菌落形态，挑取可疑单菌落进行纯培养并鉴定。

1.2.2 PCR检测 根据Oliveira等［7］设计的Hps检测引物（见表1），由上海英骏生物技术有限公司合成。对菌株进行16SrDNA（M75065）测序，通用引物（27F和1492R，见表1）由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.3 药敏试验 美国临床和实验室标准系会（Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI）中尚无Hps药物敏感性测定的标准方法。胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）与Hps亲缘性较近且均为猪呼吸道病的病原菌，所以本实验采用CLSI（2013）中规定的胸膜肺炎放线杆菌药敏测定方法。根据CLSI推荐的方法采用琼脂稀释法，测定62株Hps对21种抗菌药的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentrations，MICs）。以胸膜肺炎放线杆菌ATCC27090作为质控菌株。料分离率最高，为29.3%（12/41），C、D和E屠宰场分离率最低。

表 1 PCR 扩增引物Table 1 PCR primers used in this study

2 结果

2.1 副猪嗜血杆菌的形态特征 Hps属于兼性厌氧菌，初次分离培养时供给5%～10%的CO2可促进生长。在TSA固体培养基上37℃培养24～48 h，生长的菌落呈圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、灰白色半透明的小菌落［8］，见图1。

图 1 副猪嗜血杆菌分离株在 TSA 培养基上的菌落形态Fig.1 Colonial morphology of H. parasuis isolates in TSA

2.2 副猪嗜血杆菌PCR鉴定与测序 对分离菌进行PCR初步鉴定，扩增产物为822 bp大小的片段。选取菌株C3进行测序，证实其序列与Hps 16S rDNA序列相符，以C3菌株作为PCR初步检测的阳性对照，结果见图2。Hps一般条件下难以分离和培养，检出率较低，本次调查共采集484个样品，最终分离到62株Hps。Hps 分离率仅为12.8%，由表2可知，养殖场病

图2 副猪嗜血杆菌分离菌株的PCR鉴定结果Fig.2 The result of PCR for H. parasuis isolates

2.3 抗菌药物敏感性试验结果

2.3.1 副猪嗜血杆菌耐药性 当质控菌株的MICs在规定范围时，记录试验菌株的结果。细菌耐药临界点参照CLSI相关标准。62株Hps对21种抗菌药的MIC见表3。由表可知，所有菌株都对阿奇霉素、替米考星、泰妙菌素、阿米卡星、头孢噻呋和左氧氟沙星敏感，其中90%以上菌株对红霉素（60，96.8%）、氟苯尼考（59，95.3%）、氯霉素（60，96.8%）、庆大霉素（60，96.8%）、壮观霉素（61，98.4%）、青霉素（57，91.9%）、氨苄青霉素（57，91.9%）和环丙沙星（61，98.4%）敏感。对四环素和恩诺沙星耐药率较高，分别为75.8%和30.6%。总体而言，本研究中Hps对四环素类、氟喹诺酮类药物药物耐药率相对较高，对β-内酰胺类、氯霉素类、大环内酯类、氨基糖苷类也存在一定程度的耐药，但不显著。因为CLSI-折点没有有关克林霉素、卡那霉素、安普霉素、阿莫西林、多西环素的标准，故耐药株的比例无法确定。

表 2 2013～2014 年副猪嗜血杆菌分离率Table2 The isolation rate of Haemophilus parasuis in 2013-2014

2.3.2 多重耐药性与耐药谱 根据药敏试验结果对试验菌株多重耐药性进行分析可知，Hps耐1种和2种药物的菌株数最高，9.7%的菌株对3种以上的抗菌药耐受，37.1%的菌株对2种以上的抗菌药耐受。Hps可最多同时耐5种药物，但耐药菌株比例较低少（1.6%），见表4。本研究主要耐药谱型有17种，见表5。

表 4 副猪嗜血杆菌的多重耐药性Table 4 Multiple resistance of Haemophilus parasuis

3 讨论

近年来，副猪嗜血杆菌病在养殖场发生率逐年升高，给养猪业带来极大损失，而其细菌耐药性问题也已引起各国科学家关注。在丹麦Hps临床分离株中，发现三甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑耐药菌株［3］。在英国和西班牙Hps临床分离株中，发现英国分离株仅20%的菌株对新霉素耐药，而西班牙分离株对青霉素、氨苄青霉素、土霉素、红霉素、替米考星、硫姆林和三甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑都存在耐药现象。此外，西班牙菌株中存在多重耐药菌株，其中23.3%菌株可耐8种抗菌药物以上［4］。丹麦、西班牙和英国试验菌株中均未发现耐氟苯尼考菌株［3，4］，由于氟苯尼考极高的活性，它已成为Hps感染治疗传统药物的优秀替代品。氟苯尼考属氯霉素类广谱抗菌药，是用于临床防治猪呼吸道细菌病的重要药物。在针对Hps耐药性研究文献中，包括丹麦、西班牙以及中国均未发现氟苯尼考耐药菌株。值得注意的是，本研究中首次发现3株Hps表现氟苯尼考耐药（MICs=8μg/mL），后续将对其耐药机制进行深入研究。

表5 副猪嗜血杆菌抗菌谱Table 5 Antibacterial spectrum of Haemophilus parasuis

2000年以来，我国其他各地关于猪场发生多发性浆膜炎和关节炎的报道陆续增多，特别是近几年急骤上升。在中国临床分离株中，Zhou等［5］对110株Hps进行了耐药流行病学调查，发现存在较多的恩诺沙星和三甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑的耐药菌株，同时发现耐青霉素、氨苄青霉素、四环素、红霉素、庆大霉素、大观霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和泰妙菌素等的菌株；Xu等［6］对112株Hps进行了耐药流行病学调查，发现存在较多的耐萘啶酸和三甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑的菌株，少数菌株对头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素和庆大霉素也存在耐药现象。研究显示Hps临床抗菌药物耐药情况逐渐增多，对养殖业带来越来越大的损失，因此做好临床耐药性监测成为兽医工作者的重中之重。本次调查结果显示，Hps对四环素类、氟喹诺酮类药物耐药率相对较高，对β-内酰胺类、氯霉素类、大环内酯类、氨基糖苷类也存在一定程度的耐药，但并不显著。Hps多重耐药现象并不十分严重，共23株菌（37.1%）对2种以上的抗菌药耐受，6株菌（9.7%）对3种以上的抗菌药耐受。

在实际生产中常用大量抗菌药来治疗细菌性疾病，误用、滥用抗菌药对细菌产生较强的药物选择压力，从而使得细菌耐药情况愈加突出。虽然本次调查显示耐药情况并不十分突出，但值得注意的是，Hps对临床常用的四环素类、氟喹诺酮类抗菌药已产生较强耐药性。因此，建议在实际生产中，采用细菌体外分离培养与鉴定确诊病原后，结合药敏试验结果有针对性的用药，避免盲目滥用、长期使用同种抗菌药物。同时可对养殖场进行定期细菌药敏监测，为临床用药提供数据支撑与指导。

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ISOLATION AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF HAEMOPHILUS PARASUIS IN SHANGHAI

ZHANG Yue， LI Bei-bei， WEI Jian-chao， SHAO Dong-hua， LIU Ke， SHI Yuan-yuan，QIU Ya-feng， MA Zhi-yong
（ Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241，China）

The aim of this study was to investigate antibiotic resistance in Haemophilus parasuis isolates in Shanghai and thereby to provide data support for antibiotc use in clinical and prevention of H. parasuis infection. 62 H. parasuis were isolated from 484 samples. Minimal inhibitory concentrations （MICs） of 21 antibiotics were determined by agar dilution method. Susceptibility test showed that all isolates were susceptible to azithromycin， tilmicosin， tiamulin， amikacin， ceftiofur and levofloxacin. At least 90% of them were susceptible to erythromycin （60， 96.8%）， florfenicol（59， 95.3%）， chloramphenicol（60， 96.8%）， gentamicin （60， 96.8%）， spectinomycin（61， 98.4%）， penicillin （57，91.9%）， ampicillin （57， 91.9%） and ciprofloxacin （61， 98.4%）. Resistance to tetracycline and enrofloxacin were found in 75.8% （47） and 30.6% （19） of the isolates， respectively. Resistance to at least 2 antibiotics was observed in 37.1% of the isolates. The results of this study indicated that antibiotic resistance in H.parasuis isolates of Shanghai was not too severe. However， resistance to some antibiotics has emerged and enhanced， and continued efforts are needed to monitor the drug susceptibility of the H. parasuis isolates.

Haemophilus parasuis； antibacterial drugs； antibiotic resistance； swine

S852.612

A

1674-6422（2015）04-0025-06

2015-03-20

国家自然科学基金项目（31302145）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目

张悦，女，硕士研究生，预防兽医学专业

马志永，E-mail: zhiyongma@shvri.ac.cn