GC-MS法分析比较两种处理方式所得酵母细胞自溶成分

赵 巍， 孙 喆， 郑艳秋， 赵小丽， 甄玉国，2*

（1.吉林农业大学吉农博瑞奶牛饲料研发中心，吉林长春 130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春 130114）

酵母细胞自溶物是指酵母细胞内的物质经过物理或化学手段使细胞内部释放的物质，其成分复杂，包括糖类、蛋白质、氨基酸、有机酸、无机盐、酶类、核酸、B族维生素等（李祥等，2001）。

酵母细胞自溶物具有降血压、降血脂、促进伤口愈合、促进动物和微生物生长等多种生理活性作用。研究这些化学成分，对于进一步阐明酵母细胞代谢过程和调控机制有重要的意义。本试验利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析酵母细胞自溶物的乙酸乙酯萃取物，比较不同促溶剂所得酵母细胞自溶物所含挥发性成分的差别，初步探讨酵母细胞自溶物的主要化学成分，以为酵母细胞代谢的基础研究积累数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及药品来源 发酵罐，上海百仑生物有限公司；气相色谱质谱仪，安捷伦公司；水浴锅，无锡市苏德试验设备有限公司；pH计，上海科晓科学仪器有限公司；氯化钠，北京北化有限公司；木瓜蛋白酶，武汉万荣科技发展有限公司。

1.2 样品采集与处理 取高密度发酵所得酵母发酵液 （菌体密度为干重46.12 g/L），5000 r/min离心后得到的菌体用蒸馏水洗涤3次后，所得菌体按照以下条件进行自溶。

以NaCl为促溶剂的自溶条件：添加与酵母菌体湿重同等重量的蒸馏水，添加酵母细胞干重9%的NaCl，调节pH为5.0，控制温度40℃ 12 h，50 ℃ 24 h，60℃ 12 h。

以木瓜蛋白酶为促溶剂的自溶条件：添加与酵母菌体湿重同等重量的蒸馏水，添加酵母细胞干重1%的木瓜蛋白酶，调节pH为6.0，控制温度55℃ 48 h。

自溶结束后置于85℃水浴保持15 min灭酶活，5000 r/min离心10 min，上清液即为酵母细胞自溶液。

取10 mL酵母细胞自溶液，置于分液漏斗中，加入2倍量乙酸乙酯，充分振摇，静置，待分层后吸取上清液，重复两次，将乙酸乙酯层挥干后用1 mL丙酮定容，密封，4℃储存，测定时10000 r/min离心5 min，取上清液直接注入气相色谱与质谱联用仪器进行分析。

1.3 仪器与测定条件 仪器：气相色谱GC7890/质谱MS5970联用仪（美国安捷伦公司）。

气相条件：色谱柱为HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，柱温70℃（保留5 min），以4℃/min升温至100℃，保持5 min；以10℃/min升温至150℃，保持10min；以5℃/min升温至240℃，保持8 min；以10℃/min升温至270℃，保持5 min；载气为高纯He（99.999%）；柱前压 7.62 psi，载气流量 1.0 mL/min；进样量 1 μL；分流比 10∶1，溶剂延迟时间 3 min。

质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；接口温度280℃；质量范围20～800 amu。谱图检索：Nist11谱库（Thompson 等，1997）。

2 结果与分析

对不同促溶剂所得酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物进行GC-MS分析。通过MSD化学工作站，Nist11质谱图库进行鉴定。按峰面积归一化法进行计算求得各化学成分在样品中的相对含量。由表1可知，以NaCl为促溶剂的酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物共分离出49种化合物，鉴定了其中28种化学成分，相对总量为92.14%，总离子流图见图1。以木瓜蛋白酶为促溶剂的酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物共分离出49种化合物，鉴定了其中27种化学成分，相对总量为91.006%，见表1，总离子流图见图2。

图1 以NaCl为促溶剂的酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物总离子流图

图2 以木瓜蛋白酶为促溶剂的酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物总离子流图

3 讨论与结论

酵母细胞自溶物的成分极其复杂，本试验通过萃取的方式去除酵母细胞自溶物中大分子物质（蛋白质、多肽、多糖等），保留中极性小分子物质。通过GC-MS分析添加不同促溶剂 （NaCl和木瓜蛋白酶）所得酵母细胞自溶物的乙酸乙酯萃取物中的挥发性成分。添加NaCl所得自溶物的乙酸乙酯萃取物共分离出49种成分，鉴定出28种，占总量的 92.14%，其中酯类3种，酸类5种，醇类4种，杂环类6种（吡咯、呋喃、吡咯并吡嗪、嘧啶、吡唑等），酚类2种、饱和芳香烃3种、饱和脂肪烃5种；添加木瓜蛋白酶所得自溶物的乙酸乙酯萃取物中共分离出49种成分，鉴定出27种，占总量的91.006%，其中酯类2种，酸类4种，醇类4种，杂环类7种（吡咯、呋喃、吡咯并吡嗪、嘧啶、噻唑、吡喃等），酚类5种，饱和芳香烃2种，不饱和芳香烃2种，以及腈类1种。

表1 不同促溶剂所得乙酸乙酯萃取物GC-MS成分分析

不同处理方式所得酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物共有21种成分，二者含量大于1%的共有化合物有：异辛酯邻苯二甲酸、二异辛酯邻苯二酸、4-羟基-4-甲基-2-戊酮、3-甲基-丁酸、甘油、2，4-二苄基-5，8-二甲氧基-6-甲基-1-萘酚、2，4-双（1，1-二甲基乙基）-苯酚、苯乙醇、棕榈酸、4-羟基-苯乙醇、甲基丙二酸二乙酯等11种。

以NaCl为促溶剂的酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物较木瓜蛋白酶为促溶剂的酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物多出：十八烷、二十烷、二十四烷、二十六烷等饱和烃，1，3-二甲基苯和甲基丙二酸二乙酯6种物质。以木瓜蛋白酶为促溶剂的酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物较以NaCl为促溶剂的酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物多出：苯甲酸、4-甲基-5-噻唑、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3-（4-羟基苯基）丙腈、3-（2-乙氧基）-苯酚、3，4，5-三甲氧基-苯酚等 6种物质。

将两个总离子流图中Y轴均置于2000000，可粗略比较两种酵母细胞自溶物乙酸乙酯萃取物的成分含量。两组中以NaCl为促溶剂组含量较高的有：4-羟基-苯乙醇、1-甲基-3-丙基-1H-吡唑-5-羧酸 （4-（甲硫基） 苯甲酸）、2-（苯基乙炔基）-吡啶、3-（2-乙氧基）-苯酚、吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮、六氢-3-（2-甲基丙基）等；以木瓜蛋白酶为促溶剂组含量较高的有：2，4-双 （1，1-二甲基乙基）-苯酚、棕榈酸、十八烷酸等。

以木瓜蛋白酶为促溶剂所得酵母细胞自溶物香味较浓且为肉香味，以NaCl为促溶剂所得酵母细胞自溶物组香味较淡，气味清香。这可能是由于两者具有的挥发性物质种类及含量有所差异造成的（Peter，2000）。

目前多以GC-MS研究酵母发酵酒精饮品（白酒、啤酒、红酒）等的香味成分以改善酒类产品的口味，研究酵母抽提物的挥发性成分以生产不同味道的酵母味素（沈国惠等，1991）。产酒精发酵结束后，酵母菌培养基中挥发性代谢物多为短链脂肪酸醇酯等，包括乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯、癸酸乙酯等及醇类中的苯乙醇等香味物质（陶兴无，2004）。酵母抽提物多采用SPME-GCMS进行香味成分分析。本研究利用乙酸乙酯萃取酵母细胞自溶物与文献报道SPME-GCMS所得成分差异较大（李祥等，2001），与其相比含有较多大分子物质以及芳香烃等。由于生产工艺、原料来源、产品批次的不同会得到不同的结果，但此结果也可能是由于萃取方法不同所导致。

[1]李祥，彭莉，王毅，等.酵母抽提物辐照挥发性成分分析[J].中国酿造，2001，115（5）：17 ～ 19.

[2]沈国惠，刘杨氓，施翔，等.啤酒酵母自溶条件的优化及其抽提物的挥发性风味成份[J].食品与发酵工业，1991，3：8 ～ 17.

[3]陶兴无.酵母抽提物香气活性化合物的分离与鉴定 [J].中国酿造，2004，141（12）：13 ～ 16.

[4]Peter.酵母萃取物中挥发性含硫香味成分的研究[J].农业知识，2000，16：51～62.

[5]Thompson J，Robbins E，Baker L.The Nonhomogeneity of Soybean-“Gamma-Sitosterol”[J].Sterols，1997，62（5），505 ～ 512.