超声波协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的研究

王广慧， 张腾霄， 于德涵

（黑龙江省绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化 152061）

金针菇[Flammulina velutiper（Fr.)Sing]，学名毛柄金钱菌。研究表明，金针菇多糖是一种非特异免疫刺激剂，具有降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、护肝、抗衰老等作用，既可开发为功能性食品，也可作为动物饲料添加剂使用 （张圣杰等，2014；黄琼等，2014；张丽霞和赵丽娟，2014）。传统的金针菇多糖提取方法有：热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法等。大量试验表明，热水浸提法提取时间长、杂质多且只能提取胞外多糖；稀酸浸提法易引起糖苷键断裂；稀碱浸提法提取的多糖中杂质多，还易导致多糖降解。本研究尝试使用超声波协同高压热水浸提技术提取金针菇多糖，并通过单因素试验和正交试验对金针菇多糖的提取工艺进行了优化，以期为开发利用金针菇资源开辟一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 金针菇，购于绥化市大润发超市；无水乙醇、苯酚、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、浓硫酸、三氯乙酸等，均为国产分析纯；高速万能粉碎机（FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司）、超声波细胞粉碎仪（JY92-ⅡDN型，宁波新芝生物科技有限公司）、立式压力蒸汽灭菌器（BL-50A型，上海博讯实业有限公司）、电热恒温水浴锅（DK-98-ⅡA型，天津市泰斯特仪器有限公司）、紫外可见分光光度计（752型，上海菁华科技仪器有限公司）。

1.2 测定方法及试验参数的确定 以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖含量（北京大学生物系生物化学教研室，1980）。

多糖提取率/%=多糖量/金针菇子实体干重×100；

多糖量=总糖量-还原糖量。

1.3 超声波协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的操作方法 金针菇经除杂、50℃烘箱干燥以及高速万能粉碎机粉碎（80目）等预处理后，得到金针菇子实体干粉。准确称取金针菇粉若干份，每份1.0 g，放入烧杯中，按一定比例加入蒸馏水，先进行超声波处理，再进行高压热水浸提。提取后离心，取上清液，用70～80℃水浴浓缩至原体积的1/2，然后按1∶3的体积比加入15%三氯乙酸溶液后静置12 h，离心，将上清液适当浓缩后按1∶3的体积比加入95%乙醇，4℃下醇沉过夜，离心，将沉淀用无水乙醇洗2～3次后用蒸馏水溶解并定容，适当稀释后即可测总糖含量和还原糖含量。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 料液比对金针菇多糖提取率的影响 取5份金针菇粉，分别按照料液比（g/mL）为 1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 加入蒸馏水，然后在功率 300 W下超声波处理6 min，再在108℃下高压热水浸提80 min。后面的处理方法如1.3所述。

1.4.2 超声波功率对金针菇多糖提取率的影响取5份金针菇粉，均按最佳料液比加蒸馏水，分别在 200、250、300、350、400W 功率下超声波处理6 min。再在108℃下高压热水浸提80 min。以后的处理方法如1.3所述。

1.4.3 超声时间对金针菇多糖提取率的影响 取5份金针菇粉，在最佳料液比、最适超声波功率的条件下分别超声波处理 2、4、6、8、10 min， 再在108℃下高压热水浸提80 min。以后的处理方法如1.3所述。

1.4.4 高压热水浸提温度对金针菇多糖提取率的影响 取5份金针菇粉，在最佳料液比、最适超声波功率、最佳超声时间的条件下，分别在75、90、108、115、121℃进行高压热水浸提80 min。后面的处理方法如1.3所述。

1.4.5 高压热水浸提时间对金针菇多糖提取率的影响 取5份金针菇粉，在最佳料液比、最适超声波功率、最佳超声时间及最佳高压热水浸提温度的条件下，分别设置高压热水浸提时间为40、60、80、100、120 min。 后面的处理方法如 1.3所述。

1.5 正交试验设计 在单因素试验的基础上选择对金针菇多糖提取率影响较大的因素进行正交试验，以确定金针菇多糖提取工艺的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 测定方法及试验参数的确定

2.1.1 苯酚-硫酸法测总糖的标准曲线 根据试验结果得到苯酚-硫酸法测定总糖的标准曲线，其线性回归方程为：y=0.0071x-0.0049，R2=0.9902。

2.1.2 3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测还原糖的标准曲线 根据试验结果得到DNS法测定还原糖的标准曲线，其线性回归方程为：y=0.001x+0.0658，R2=0.9981。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对金针菇多糖提取率的影响 试验设置了 5 个不同的料液比，分别为 1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，获得的提取率分别为 12.18%、13.24%、15.61%、14.73%、13.36%。由此结果可知，提取金针菇多糖的最佳料液比为1∶50。

2.2.2 超声波功率对金针菇多糖提取率的影响试验设置5个不同的超声波功率，分别为200、250、300、350、400 W，得到的提取率分别是14.72%、14.25%、15.61%、15.32%、14.17%。由此结果可知，提取金针菇多糖的最佳超声波功率为300 W。

2.2.3 超声时间对金针菇多糖提取率的影响 试验设置5个不同的超声时间，分别为2、4、6、8、10 min，提取率分别为13.54%、14.33%、15.61%、14.45%、13.83%。由此结果可知，超声时间为6 min时，多糖提取率最高。

2.2.4 高压热水浸提温度对金针菇多糖提取率的影响 试验设置5个不同的高压热水浸提温度，分别是 75、90、108、115、121 ℃， 得到的提取率分别为 13.74%，14.91%、15.61%、15.24%、14.57%。由此结果可知，高压热水浸提温度为108℃时，多糖提取率最高。

2.2.5 高压热水浸提时间对金针菇多糖提取率的影响 试验设置5个不同的高压热水浸提时间，分别是 40、60、80、100、120 min。 得到的提取率分别为 12.61%，14.83%、15.61%、14.48%，13.76%。由此结果可知，高压热水浸提时间为80 min时，多糖提取率最高。

2.3 正交试验结果 在单因素试验的基础上选择对金针菇多糖提取率影响较大的因素进行L16（45)正交试验。试验因素水平设计见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果

由表2可知，各因素对提取率的影响大小顺序为 A（料液比）＞C（超声时间）＞E（高压热水浸提时间）>B（超声波功率）＞D（高压热水浸提温度）。由此确定提取金针菇多糖的最优条件为A2C2E2B3D2，即：料液比为 1∶50（g/mL），超声时间为6 min，高压热水浸提时间为80 min，超声波功率为300 W，高压热水浸提温度为108℃。在此条件下金针菇多糖提取率为15.64%。

3 讨论与结论

超声波提取是依靠超声波产生的 “空化作用”对细胞膜的破坏所形成的强大冲击波或高速射流对有效成分与水相之间阻滞层进行消除的一种提取技术，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于提取。在高压条件下，被提取物的组织细胞及亚细胞结构发生了解体，从而使细胞内成分能够与溶媒充分接触而更易被释放。超声波协同高压热水浸提法综合了两种提取技术的优点，使多糖更容易从细胞中释出，因此获得了较高的提取率。本研究通过单因素试验和正交试验对超声波协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的工艺条件进行了优化。

试验结果表明，超声波协同高压热水浸提法提取金针菇多糖可获得较高的提取率。此法提取多糖的最适条件是：料液比为 1∶50（g/mL），超声波功率为300 W，超声时间为6 min，高压热水浸提温度为108℃，高压热水浸提时间为80 min。在此条件下，金针菇多糖提取率为15.64%。

[1]北京大学生物系生物化学教研室.生物化学试验指导[M].北京：人民教育出版社，1980.22～24.

[2]黄琼，黄晓梅，张平，等.金针菇多糖的抗氧化活性[J].食品研究与开发，2014，35（4)：66 ～ 69.

[3]张丽霞，赵丽娟.金针菇多糖的抗氧化活性研究 [J].西南农业学报，2014，27（1)：240 ～ 243.

[4]张圣杰，陈相艳，李文香，等.超声联合超微粉碎法提取金针菇多糖新探究[J].食品工业，2014，35（4)：83 ～ 86.