胃癌组织中DPC4 和PTEN 蛋白表达特点及临床意义

曾 伟，戴益琛

解放军174 医院消化内科，福建 厦门361003

胃癌的发生、发展是个多阶段过程，与多种癌基因激活和抑癌基因失活有关。近年有文献报道一些抑癌基因的表达缺失与胃癌的发生、转移、临床病理特征及预后关系密切［1-2］。其中DPC4 及PTEN 基因备受关注。位于染色体18q21.1 的DPC4 基因编码的蛋白在多种肿瘤中发挥抑制癌细胞作用，但在胃癌中研究报道甚少［3］。PTEN 基因是目前发现的第1 个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，其编码的蛋白在细胞生长、黏附、迁移、浸润及凋亡等方面具有重要作用［2］。同时PTEN 与DPC4 之间关系目前尚未明确。针对上述问题，我们采用免疫组化的方法对胃癌组织中DPC4、PTEN 蛋白的表达进行检测，旨在探讨两者在胃癌发生、发展中扮演的角色。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取解放军174 医院2013 年5月-2014 年8 月手术切除并经病理检查证实的胃癌患者60 例，所有患者术前均未行放疗、化疗、生物治疗等肿瘤针对性治疗。男32 例，女28 例;年龄29 ～71岁，平均年龄(59.1 ±2.5)岁;淋巴结阳性者26 例、淋巴结阴性者34 例;临床分期:Ⅰ期16 例、Ⅱ期16 例、Ⅲ期4 例、Ⅳ期24 例。对照组:随机选取30 例癌旁5 cm 以外的正常胃黏膜标本。

1.2 实验试剂 鼠抗人DPC4 免疫组化单克隆抗体，鼠抗人PTEN 免疫组化单克隆抗体;制片使用LEICA RM2255 型切片机CS-VI 型摊片烤片机;DAB 酶底物显色试剂盒及SP 试剂盒均购自福建迈新生物技术有限公司;阅片使用Olympus 显微镜。

1.3 免疫组织化学染色 每例组织均取4 μm 厚切片5 张，其中3 张行DPC4 及PTEN 免疫组化染色，1张行HE 染色，另外用PBS 代替一抗作为阴性对照。切片常规脱蜡，置于3%过氧化氢中浸泡10 min，使用梯度酒精脱水。高温高压热修复维持15 min，后经自然冷却至25 ℃。加入一定量的一抗，10%山羊血清封闭20 min，4 ℃冰箱过夜，后滴加50 μl 生物素标记的二抗，25 ℃孵育10 min。DAB 显色，显微镜下观察，蒸馏水终止反应。苏木素轻度复染，0.1%酒精分化，使用梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 结果判定 DPC4 和PTEN 阳性表达为浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒，均定位于细胞浆内。(1)依据细胞染色强度评分:无染色计0 分，浅黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分;(2)按照阳性细胞数占全部细胞数百分比计分:＜5%计0 分，5% ～20%计1分，21% ～50%计2 分，51% ～70%计3 分，＞71%计4分。两者评分相乘:0 ～3 分设为阴性(-);4、6 分为阳性(+)，8、9、12 分为强阳性(+ +)［4］。

1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0 统计学软件进行分析，DPC4、PTEN 蛋白水平用χ2检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义;采用Spearman 相关性分析DPC4 与PTEN 蛋白之间的相关性。

2 结果

2.1 DPC4 和PTEN 蛋白的表达 DPC4 阳性表达主要定位于细胞质，呈棕黄色或棕褐色染色。在正常胃黏膜和胃癌组织中DPC4 的阳性表达率分别为96.7%和43.3%，差异有统计学意义(χ2=9.16，P ＜0.05)。PTEN 阳性表达主要定位于细胞浆，呈棕黄色染色。在正常胃黏膜中PTEN 的阳性表达率为93.3%，在胃癌组织中为38.3%，差异有统计学意义(χ2=11.53，P ＜0.05，见图1)。

图1 DPC4 及PTEN 在胃癌组织中的表达(100 ×) A:DPC4;B:PTENFig 1 Expression of DPC4 and PTEN in gastric cancer (100 ×) A:DPC4;B:PTEN

2.2 DPC4、PTEN 蛋白的表达与胃癌临床病理参数的关系 胃癌组织中，淋巴结转移阴性组中DPC4、PTEN 蛋白表达水平均高于淋巴结转移阳性组(P ＜0.05);DPC4、PTEN 蛋白的表达随临床分期的升高而降低，差异有统计学意义(P ＜0.05);浆膜层中DPC4、PTEN 蛋白表达水平低于肌层，差异有统计学意义(P ＜0.05);DPC4、PTEN 蛋白的表达水平与年龄、性别无相关性(P ＞0.05，见表1)。

表1 DPC4 和PTEN 蛋白的表达与胃癌临床病理参数之间的关系［例数(%)］Tab 1 Expressions of DPC4 and PTEN in gastric cancer and their relationships with the pathology［n(%)］

续表1

2.3 胃癌组织中DPC4、PTEN 蛋白表达的相关性经Spearman 相关性分析，胃癌组织中PTEN 蛋白表达与DPC4 蛋白表达呈正相关(r=0.827，P ＜0.05)。

3 讨论

胃癌的演进是一个复杂的过程，涉及多种相关基因的调控［1］。DPC4 基因位于人染色体18q21.1，含11个外显子和10 个内含子，基因编码产物DPC4 蛋白是转化生长因子β 超家族受体的底物，具有抑制肿瘤转移及细胞生长等作用，研究发现该基因缺失或突变可使TGF-β 超家族成员表达下调，进而促进细胞异常增生或癌变［5-6］。也有学者发现DPC4 基因的缺失或突变多发生在肿瘤进展期，并与癌细胞浸润和转移密切相关［7］。而本研究发现DPC4 蛋白在胃癌中呈低表达。因此，我们认为DPC4 蛋白低表达也可能独立阻滞肿瘤的浸润及转移，在胃癌中，DPC4 蛋白可被视为一个独立的肿瘤抑制蛋白。然而另一个与胃癌关系密切的PTEN 蛋白在胃癌发生、发展过程中扮演的角色尚未明确。该基因的突变、缺失及甲基化对细胞增生的负向调控和抑癌作用的丧失引起肿瘤的进展［8-9］。本研究证实PTEN 蛋白在正常胃黏膜组织中的阳性表达率显著高于胃癌组织，这一结论与Liu 等［10］报道相似，表明PTEN 蛋白在胃癌发生、发展过程起重要作用。本研究同时还发现胃组织中淋巴结转移阴性的PTEN 蛋白的阳性表达率高于淋巴结转移阳性者，PTEN 蛋白阳性表达率随癌细胞浸润深度的加深而减弱，在胃癌组织中，PTEN 蛋白阳性表达率随临床分期的升高逐渐降低，上述均表明PTEN 蛋白的表达可能与胃癌的局部浸润及远处转移相关。本研究发现PTEN 蛋白阳性表达的胃癌组织中，DPC4 蛋白的阴性率显著高于PTEN 蛋白阴性表达的胃癌组织中DPC4蛋白的阴性率，这说明DPC4 基因的缺失或突变阻断PTEN 蛋白抑制癌细胞生长的信号转导通路，而这种阻断作用又可能通过负反馈作用使癌细胞自分泌PTEN 蛋白增加，进而调节胃癌的发生、发展，具体机制需进一步研究。

总之，本研究提示DPC4 蛋白与PTEN 蛋白表达呈正相关，两者在胃癌组织中均发挥抑癌基因的作用。因此，分析胃癌组织标本中PTEN、DPC4 蛋白的表达情况，对于评估胃癌的发展及预后判断具有重要意义，也为临床治疗胃癌提供了一条新的思路。

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