超声波辅助溶剂法提取红景天中的多糖

鲍妮娜，于蓓蓓，孙银平

1.宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000；2.即墨市食品药品监督管理局，山东青岛，266200；

超声波辅助溶剂法提取红景天中的多糖

鲍妮娜1，于蓓蓓2，孙银平1

1.宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000；2.即墨市食品药品监督管理局，山东青岛，266200；

以红景天为研究对象，考察了超声波辅助溶剂法对多糖提取率的影响。对提取温度、提取时间及料液比进行单因素考察，以正交试验法优化提取工艺条件。结果表明：影响红景天多糖提取率的主次关系是温度>时间>料液比，最佳工艺条件为提取温度75℃、提取时间40 min、料液比1∶30，多糖提取率达到15.49%。相较于传统的水提取法，超声波辅助溶剂法在操作和多糖提取率上具有明显的优势。同时利用邻二氮菲—Fe2+氧化法测定羟自由基的清除率，以确定多糖活性。

红景天多糖；超声波辅助溶剂法；抗氧化活性

大量的研究资料表明，红景天具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、补气清肺以及兴奋大脑和脊髓等作用[1]。我国从1980年代就开始红景天的药用开发研究，一些学者对其生理活性、药用成分、栽培条件等方面进行了系统化的研究并获得了一定的成果[2-3]。红景天已被列入国家认可的药物和食品范畴，其根茎提取物已成为中成药、食品、饮料等开发产品的原料。

传统上，国内外采用热水提取法提取红景天多糖[4-5]。该法设备要求低，操作简单，但需要较长的时间且多糖损耗较多。随着科学技术的发展，现常用微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶解提取法等方法提取[6-8]。

本文采用超声波辅助溶剂法提取红景天中的多糖，并与传统水提取法进行比较，即对所提取的多糖进行含量测定[9-11]，并以羟自由基的清除率来确定多糖的活性[12]。

1 试验材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料与试剂：红景天根茎(购于宿州市人民大药店)，葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、石油醚、醋酸、邻二氮菲、硫酸亚铁、磷酸盐、Vc、过氧化氢等试剂均为分析纯。

仪器：超声波细胞粉碎机(昆山市超声仪器有限公司)，紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)，高速冷冻离心机D-37520(Osterode Kendro Laboratory Products)，RE-52AA型旋转蒸发器(上海雅荣生化仪器设备有限公司)。

1.2 方 法1.2.1 多糖含量测定

多糖含量采用苯酚—硫酸法测定。

1.2.1.1 标准曲线绘制

精确称取50 mg干燥(106℃)至恒重的葡萄糖标准品，用蒸馏水溶解定容至500 mL，分别取8支试管按表1顺序加入所需试剂，混匀，常温显色后静置10 min并在冷水中冷却25 min，在波长490 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，以OD490为纵坐标，得出标准曲线，标准曲线方程为：

y=67.414x+0.0032 (R2=0.9987)

表1 葡萄糖标准曲线试剂添加顺序表

1.2.1.2 样品测定

取一定量待测粗多糖样品，加适量水溶解后置于容量瓶中定容，按标准曲线制作的试验步骤测定吸光值，再由上述标准曲线方程计算多糖含量。

多糖提取率(%)= 提取物中多糖的质量/原料的质量×100%

1.2.2 水提取法

将3 g红景天粉末于70℃水中提取2 h，料液比为1∶30。再将提取液浓缩，醇析后离心，沉淀经无水乙醇、石油醚洗涤、干燥后即获得粗多糖，称重。

1.2.3 超声波辅助溶剂法提取

称取5份红景天粉末，每份3 g，考察超声波提取时间、提取温度以及料液比对红景天多糖提取率的影响。

试验参数设置为：

(1)超声波提取时间：10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。

(2)提取温度：60℃、65℃、70℃、75℃、80℃。

(3)料液比：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。

1.2.4 正交试验设计

采用超声波辅助溶剂提取法，称取9份红景天粉末，每份3 g，按照正交设计方案提取，根据单因素试验结果，超声波处理时间、温度和料液比每个因素选择3个水平，按照L9(33)设计安排试验(表2)。

表2 正交试验因素水平表

1.2.5 邻二氮菲—Fe2+氧化法测定多糖活性

1.2.5.1 配制溶液

配制不同浓度的Vc溶液和红景天粗多糖溶液，浓度分别为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL。

1.2.5.2 损伤吸光值

在试管中加入0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液1 mL和0.75 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，再加入1.5 mL浓度为50 mmol/L的磷酸盐缓冲液，立即混匀，并分别加入蒸馏水将每管总体积补齐至10 mL，充分摇匀，再加入0.01%的过氧化氢溶液1 mL，37 ℃保温1 h，在536 nm下测定吸光值A损失。

1.2.5.3 空白吸光值

按照1.2.5.2的步骤依次加入试剂，但不加入过氧化氢溶液，充分摇匀后37℃保温1 h，在536 nm下测定吸光值A空白。

1.2.5.4 样品吸光值

按照1.2.5.2的步骤依次加入试剂，将蒸馏水换成样品溶液，之后的步骤也同1.2.5.2，测定的吸光值为A样品。

羟自由基清除率(%)=(A样品—A损失)/(A空白—A损失)×100%

2 结果与分析

2.1 水提取法正交试验

如表3所示，比较各列极差R值，用传统水提法提取多糖的各影响因素中，提取时间对红景天多糖提取率影响最大，其次是温度，最后是料液比。比较K值，可以得出最佳因素水平为A3、B3、C2，即提取温度为80℃、时间为2.5 h、料液比为1∶30，在该条件下粗多糖得率最大，为5.76%。

表3 水提取法正交试验结果

2.2 超声波辅助溶剂法试验

图1 时间对红景天粗多糖提取率的影响

2.2.1 提取时间对红景天粗多糖提取率的影响

如图1所示，红景天粗多糖提取率随提取时间的增加先增大后减小，当提取时间为30 min时，多糖得率最高，为14.35%。30 min之后随提取时间的加长，红景天粗多糖提取率趋于下降，这可能是由于超声波的机械剪切极易破坏多糖结构造成的，因而综合考虑最佳提取时间为30 min。

2.2.2 提取温度对红景天粗多糖提取率的影响

如图2所示，红景天粗多糖提取率随提取温度的增加先增大后减小，当提取温度为70℃时，多糖得率最高，为14.89%。当温度超过70℃后红景天粗多糖提取率呈现下降趋势，这是因为温度过高时，细胞涨大，细胞壁很容易被破坏，多糖快速溶出，多糖易发生水解，且高温导致部分多糖结构被破坏。因此，选定最佳提取温度为70℃。

图2 温度对红景天粗多糖提取率的影响

2.2.3 料液比对红景天粗多糖提取率的影响

如图3所示，料液比对红景天粗多糖提取率有一定的影响，当料液比为1∶30时，多糖得率最高，为15.31%，随后降低。这是因为加水过多降低了提取液的固形物含量，同时也使得其他可溶性成分也随之增大，不利于分离，从而导致多糖提取率减小，因此料液比选为1∶30。

图3 料液比对红景天粗多糖提取率的影响

2.3 正交试验结果分析

如表4所示，比较各列极差R值，用超声波辅助溶剂法提取红景天粗多糖的各影响因素中，处理温度对红景天粗多糖提取率影响最大，其次是时间，最后是料液比。比较K值，可以得出最佳因素水平为A3、B2、C3，即处理时间为40 min、料液比为1∶30、温度为75℃，在该条件下粗多糖得率最大为15.49%。

2.4 多糖抗氧化活性测定

如图4所示，Vc对羟自由基的清除率很高，当其浓度为0.06 mg/mL时清除率达到100%，粗多糖浓度达到0.1 mg/mL时清除率也达到100%，这说明红景天粗多糖具有相对较好的抗氧化能力。

图4 Vc和粗多糖浓度对羟自由基清除率的影响

表4 超声波辅助溶剂法正交试验结果

3 结 论

本文以红景天为研究对象，考察了超声波辅助溶剂法对红景天粗多糖提取率的影响。对提取温度、提取时间和料液比进行单因素考察，以正交试验法对工艺条件进行了优化。试验结果表明：影响红景天多糖提取率的主次关系是提取温度>提取时间>料液比，最佳工艺条件为提取温度75℃、提取时间40 min、料液比1∶30，多糖提取率最高为15.49%。相较于水提取法，超声波辅助溶剂提取法，具有提取率高、较易掌控操作等优点。用邻二氮菲—Fe2+氧化法测定羟自由基的清除率，以确定多糖活性，结果表明红景天多糖具有较好的抗氧化活性。

[1]周瑞平，庄剑青，王谷强．药用植物高山红景天的资源与开发[J]．中国中医药科技，1995，2(4)：32-33

[2]董滟．红景天的药用价值与临床应用[J]．四川中医，1998，16(7)：17[3]李西林，南艺蕾．红景天多糖的化学药理研究进展[J]．中国中医药信息杂志，2006，13(3)：109-110

[4]郭巧玲．菠萝多糖的提取及其生物学活性的研究[D]．福州：福建农林大学食品科学学院，2010：22-28

[5]董周永．荔枝多糖的提取、分离纯化及抗氧化性研究[D]．西安：西北农林科技大学研究生院，2006：5-32

[6]赵慧，孙长山，贾凌云，等．正交试验优选红景天的提取工艺[J]．中成药，2005，27(11)：1344-1345

[7]David J,Sessa F J,Ellerb D E,et al.Improved methods for decolorizing[J].Industrial Corps and Products,2003,18(1):55-65

[8]Franzg.Polysaee haridesin Phanna cology.Currenta Pplie-ation and ttireeonce Pts[J].Plan Med，1998,55(6):493-497

[9]王鲁石，王莉，鲁建江．红景天叶多糖的微波提取及含量测定[J].石河子大学学报，2002，6(11)：18

[10]徐晓飞，陈健．多糖含量测定的研究进展[J].食品科学，2009，30(21)：443-447

[11]董群，郑丽伊，方积年．改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究[J].中国药学杂志，1996，31(9)：550-553

[12]金鸣，蔡亚欣，李金荣，等．邻二氮菲一Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生自由基[J].生物化学与生物物理进展，1996(6)：553-555

(责任编辑：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.12.024

2016-08-25

宿州学院教授(博士)科研启动基金资助项目(2015JB09)；宿州学院药物生物技术研究所开放课题(2015YKF04)。

鲍妮娜(1984-)，女，山东烟台人，博士，讲师，主要研究方向：天然产物提取与开发。

Q94

A

1673-2006(2016)12-0083-04