广谱流感疫苗的研究进展

谢辛慈，刘璐，袁松华，张晓燕，徐建青

复旦大学附属公共卫生临床中心，上海 201508



广谱流感疫苗的研究进展

谢辛慈，刘璐，袁松华，张晓燕，徐建青

复旦大学附属公共卫生临床中心，上海 201508

摘要：流行性感冒(简称流感)的频频暴发严重危害人类健康和公共卫生，已引起全球范围内的高度关注。预防流感最有效和经济的措施是接种疫苗，但流感病毒的持续变异可逃逸人群已有的免疫应答，目前使用的季节性流感疫苗仅对亚型内抗原匹配较好的毒株产生免疫保护作用，难以有效应对因抗原漂移或抗原转换而产生的无法预料的流感大流行。因此，研发对流感病毒不同亚型均具有交叉免疫保护作用的广谱流感疫苗具有重要意义。近年来，流感病毒广谱中和抗体的发现、对流感病毒抗原保守区域及细胞免疫机制的深入研究、疫苗免疫策略的优化等都为广谱流感疫苗的研发提供了新思路。本文简述了近几年基于血凝素、基质蛋白、核蛋白等多种流感靶抗原的广谱流感疫苗的研究进展。

关键词：A型流感病毒；广谱流感疫苗；免疫原策略；血凝素；基质蛋白2

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的严重危害人类健康和公共卫生的急性呼吸道传染病，是全球重点监测和造成死亡人数最多的传染病之一。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)统计，在世界范围内，每年有300万~500万人严重感染，25万~50万人死亡[1-2]。流感病毒属于正黏病毒科，为反义单链RNA病毒。根据其核蛋白(nucleoprotein, NP)及基质蛋白(matrix, M)的抗原性不同，可分为A、B和C型，其中B型和C型流感病毒变异相对较少[3]，未曾造成显著危害。而A型流感病毒对人类和多种动物具有致病力，曾引起4次世界大流行。1918—1919年西班牙暴发的H1N1流感大流行造成全球约5 000万人死亡，随后还有1957—1958年亚洲pN2流感、1968—1969年中国香港地区pN2流感及2009年猪来源的H1N1流感[4-5]。

A型流感病毒表面血凝素(haemagglutinin, HA)有18种类型，神经氨酸酶(neuraminidase, NA)有9种亚型，在进化和传播过程中易发生频繁且不可预测的突变，变异重组的病毒可能具有新的抗原性和致病性，可逃逸人群中已形成的免疫屏障，引起季节性或大规模的流感暴发[6-7]。接种疫苗是预防流感最有效的方法，然而目前已有的季节性疫苗只对亚型内抗原匹配较好的毒株产生免疫保护，对抗原预测的准确率不高，且疫苗生产周期长、成本高[8]。因此，不管是针对每年都在变化的季节性流感还是未知的流感大流行，广谱流感疫苗的开发都具有重要的意义。

1传统流感疫苗使用现状及存在问题

目前世界上获得批准使用的流感疫苗均为季节性流感疫苗[9]，其中最为广泛使用的为三价灭活疫苗[10]，包含两种危害较大的A型流感病毒(H1N1和pN2)和一种B型流感病毒，疫苗的保护效果取决于实际流行毒株与疫苗病毒的一致性。2013—2014年，WHO开始推荐四价疫苗[11]，在传统的三价疫苗中增加了一种B型流感病毒。少数欧美国家使用的减毒活疫苗[12]包含两种A型和两种B型流感病毒，以鼻腔喷雾方式接种，具有温度敏感性，毒株只能在鼻腔和上呼吸道复制，无法在温度较高的呼吸道下部进行复制，对2~8岁儿童有较好的保护作用，但对老人和免疫缺陷及免疫功能低下人群存在潜在危害。

WHO每年对流感进行全球性监测，预测可能流行的几种代表性病毒类型，每半年更新一次对季节性疫苗组合的建议[13]。但流感病毒在不断变化，WHO的监测与预测费时、费力，且准确率不高，为了保证当季的疫苗供应，需至少提前七八个月进行生产，这大大增加了疫苗预测的不确定性，且季节性疫苗对可能发生的大流行流感也基本无效。目前的疫苗生产主要依赖于鸡胚，其生产周期过长，工艺复杂，费时费力，成本相对较高，对鸡蛋过敏者无法接种[14]。当新型流感病毒已开始肆虐时，鸡胚显然跟不上日益严峻的市场需求，且像H5N1这样高致病性的禽流感病毒可能导致鸡胚死亡[15]。

近几年出现了采用皮下接种的疫苗，可通过减少疫苗使用剂量来缓解生产压力[16]。2012年美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准采用动物细胞代替鸡胚生产三价疫苗Flucelvax，适用于18岁以上人群。2013年批准了FluBlok疫苗[17]，为昆虫细胞系表达的三价重组蛋白疫苗，适用于18~49岁人群。这类疫苗的优点是生产周期相对短，对鸡蛋过敏者也可接种，但不适用于老人、儿童和慢性疾病患者，且生产后期步骤类同鸡胚法，仍不具备替代能力。2014—2015年推出了针对65岁以上老人的Fluzone高剂量疫苗[18]，用于应对老年人免疫系统退化带来的抗原免疫原性降低的问题，但其安全性仍需考虑，对疫苗的生产也提出了挑战。

除以上提到的病毒变异、疫苗广谱性、预测准确率、生产方式、接种人群等因素，获批使用的疫苗大多通过针对HA诱导具有中和作用的抗体以阻止病毒体内感染，具有较强的毒株特异性，缺乏广谱性。因此，如何更全面、有效、持久地激发免疫系统，提供更广泛有效的保护作用，也是目前广谱流感疫苗面临的严峻挑战。

2基于靶抗原的广谱流感疫苗研究进展

2.1基于HA的广谱流感疫苗

HA是流感病毒包膜上的跨膜糖蛋白三聚体，包括头部和杆部，具有高度变异性。头部由HA1结构域组成，介导HA与细胞表面唾液酸受体结合；杆部介导病毒与细胞膜融合，由HA2和小部分HA1结构域构成，是相对保守区域，特别是HA2亚单位N端前面的11个氨基酸，在所有已知的流感病毒中高度保守[19-20]。值得一提的是，只有针对HA的特异性抗体可通过中和作用阻止病毒体内感染。

中和抗体识别的优势抗原表位主要位于HA头部，此部位最易发生抗原漂变(antigen drift)，因此针对HA头部的中和抗体具有较强的毒株特异性，且病毒会选择性地向逃逸中和抗体方向突变，抗体很难实现交叉保护效果。HA杆部抗原性较弱，在进化过程中高度保守，杆部中和抗体可抑制低pH引起的HA2构象变化，从而阻止病毒在细胞内释放核衣壳。HA头部较多的优势表位会阻碍杆部的次优势表位被免疫系统识别，且针对HA杆部的抗体主要识别HA近膜端保守的构象表位，由于空间位阻，HA杆部中和抗体较难接近其所识别的表位，因此自然感染状态下针对HA杆部的抗体数量及中和能力均远弱于针对HA头部的抗体[21]。

在自然感染状态下，虽然HA头部在诱导中和抗体产生时具有显著的免疫优势，但头部的改变大多并不影响流感病毒的基本功能，只是改变病毒的致病性和病原性。针对HA杆部的抗体介导的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)较强，且HA杆部保守性高，此处受到攻击会使流感病毒不能存活[22]。因此，不管是针对HA头部还是杆部的疫苗研究均具有重要意义。

2.1.1靶向HA头部的广谱中和抗体

针对HA头部的广谱中和抗体大多靶向头部受体结合槽。受体结合槽是HA头部唯一的保守结构，但其周围的氨基酸残基易突变，限制了靶向受体结合槽抗体的广谱性；且结合槽内部虽然高度保守，但相对分子质量太小。因此，这类中和抗体极少[21]。大多数针对HA头部广谱中和抗体的产生与针对杆部广谱中和抗体的产生类似，可能是个体在很长一段时间内暴露和识别多种不同HA头部而产生的。2010年，Corti等[23]从一名接种季节性流感疫苗的个体中分离到FE17抗体，能中和H1和H5流感病毒；2011年，Schlütter等[24]从一名2007年流感疫情中接种疫苗的志愿者体内分离出针对HA受体结合槽的CH65抗体，可抵御36株H1流感病毒中的30种，证明以受体结合槽为靶点的疫苗研发是可行的。但目前看来，靶向HA头部的中和抗体不如靶向杆部的中和抗体更为广谱。

2.1.2靶向HA杆部的广谱中和抗体

近年来发现的流感广谱中和抗体大多靶向HA杆部。第1个杆部广谱中和抗体是1992年的鼠源单克隆抗体C179[25]，可识别H1、p、H5亚型毒株。最早的人源杆部广谱中和抗体是2008和2009年采用噬菌体展示文库筛选分离到的CR6261[26]和F10抗体[20]。这类广谱中和抗体并不能改变HA三聚体的结构，但能阻止低pH诱导的HA2蛋白结构化，目前克鲁塞尔公司已将CR6261抗体进行Ⅰ期临床试验。之后陆续发现了一些此类广谱中和抗体，这些抗体除能直接中和病毒外，还可通过ADCC和补体依赖的细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)来抵制流感病毒[27]。但杆部广谱中和抗体基本只对流感病毒Ⅰ类(H1、p、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18)或Ⅱ类(p、H4、H7、H10、H14、H15)内部具有广谱保护作用，在两类之间几乎没有交叉保护作用[28]。2015年高福等[29]发现了杆部广谱中和抗体CT149，对Ⅱ类流感病毒和部分Ⅰ类流感病毒有交叉保护作用。由于自然感染状态下HA杆部为免疫次优势部位，因此如何诱导针对免疫原性较弱的HA杆部广谱中和抗体的产生以充分发挥其作用至关重要。

2.1.3基于广谱中和抗体的疫苗设计

有研究显示，在H5N1感染幸存者体内发现的杆部广谱中和抗体在2009年的H1N1毒株刺激下，抗体水平显著增加，因此猜测机体被具有不同HA头部的流感疫苗免疫后可增加杆部的抗体效价[30]。有研究利用H5N1、H7N1和猪来源的H1N1毒株构建了疫苗，免疫结果显示其更倾向于活化杆部抗体，也支持了这种假说[31]。目前认为流感广谱中和抗体的产生与个体对流感病毒的暴露史密切相关，第1次暴露的病毒类型可能非常重要，清楚暴露史对疫苗的设计具有重要意义[28]。受益于这种假说的几种疫苗策略已在许多研究中显示了较好的免疫保护效果。

为活化HA杆部广谱中和抗体，诸多研究根据预测的HA杆部广谱中和抗体表位或HA0酶切位点等设计多肽疫苗[32-33]。有研究以缺失头部的p蛋白作为免疫原构建疫苗，结果显示能保护小鼠免受p亚型病毒的攻击，保护部分小鼠免受不同亚型病毒的攻击[34]；有研究基于H1N1和pN2构建了缺失HA头部的DNA疫苗和病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗，共同免疫小鼠后显示了较弱的免疫保护效果[35]；基于p亚型病毒高度保守的HA2 α-螺旋合成肽疫苗，能诱导小鼠产生不同水平的针对H5和H1亚型病毒的免疫保护反应[36]。

目前，更多研究致力于削弱占免疫优势的HA头部免疫反应，同时增强HA杆部的免疫反应。如采用初免-加强免疫策略，即用DNA疫苗进行初免，蛋白疫苗或病毒载体疫苗等进行加强免疫。有研究以H5N1 HA杆部作为DNA疫苗进行初免，用H5N1灭活疫苗进行加强免疫，显示小鼠体内产生了高效价的针对HA杆部的广谱中和抗体[37]。为更好地刺激HA杆部广谱中和抗体产生，许多研究将不同种的HA头部与同种HA杆部组合成多个新的嵌合HA(chimeric haemagglutinin, cHA)进行多次免疫，由此摆脱HA头部的免疫优势，充分活化针对杆部的抗体；且多个不同的HA头部在一定程度上模拟了自然状态下机体被多种流感病毒感染的过程，也有助于机体产生广谱免疫反应[38]。但在H5N1疫苗研究中发现，首先接种能活化高水平杆部抗体的疫苗，其后若接种同样的疫苗则主要产生了针对头部的抗体应答[38]。这一现象暗示免疫的cHA头部一旦与机体免疫系统曾接触的流感病毒一样或类似，头部会迅速重新获得免疫优势，无法充分活化杆部抗体。许多研究中，cHA策略在体内实验中显示了较好的免疫保护效果，但仍具有优化空间。

2.2基于M2的广谱流感疫苗

M2是A型流感病毒的3种表面抗原之一，是流感病毒囊膜上的一种四聚体通道蛋白，稀疏地分布在病毒颗粒表面，但大量分布在感染细胞表面。在病毒感染过程中，可通过降低pH使HA产生构象变化，促使膜融合而释放病毒核酸。M2的保守程度较高，其N端的24个氨基酸组成M2的胞外区(M2e)，是流感病毒中最保守的部分，被认为是广谱流感疫苗研发的重要靶蛋白。目前已有多个基于M2的疫苗进入临床试验阶段[39-40]。

针对M2的抗体不能中和、清除病毒，很可能是通过ADCC发挥作用。研究显示，针对M2e的单克隆抗体14C2虽不显示血凝抑制活性，但过继14C2抗体的小鼠在攻毒后，与对照小鼠相比，肺部病毒滴度降低了100倍左右，肺部损伤相对减轻。此项研究证实，基于流感病毒M2e的抗体可产生一定的免疫保护作用[41]；表达M2的昆虫杆状病毒颗粒与全病毒灭活疫苗组合，可保护小鼠抵抗多种流感病毒的攻击[42]。

目前研究均显示，基于M2的广谱流感疫苗的设计安全性高，免疫原性和耐受性良好，没有显著不良反应。M2相对分子质量小，引起的免疫反应弱而短暂，且这种免疫保护作用仅仅针对A型流感病毒，因此目前有很多策略来增强M2的免疫原性，如添加佐剂、将M2或M2e进行多聚体表达、与免疫原性较强的大分子蛋白融合表达、通过腺病毒载体表达构建VLP等[41]。中国科学院上海巴斯德研究所周东明等[43]采用VR1区缺失的腺病毒载体构建了M2e流感疫苗，显示了较好的免疫保护效果。

2.3基于NP的广谱流感疫苗

流感病毒NP蛋白是与病毒遗传物质RNA结合的主要成分，其氨基酸序列高度保守，在所有A型流感病毒株中保守性达90%左右[44]。NP为病毒内部蛋白，并不暴露于病毒表面，也不表达于感染细胞表面，因此主要诱导机体产生细胞反应，特别是细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反应[45]。针对NP的特异性抗体在降低病毒载量、加快病毒清除及交叉免疫保护中发挥重要作用，可通过ADCC途径发挥效应[46]。在免疫三价流感疫苗的研究中发现，人体内NP抗体很难被活化，且抗体水平个体差异很大，因此NP抗体介导的ADCC在人体中能否发挥广谱保护作用仍有待进一步研究[47]。

Lillie等[48]构建了基于H1N1流感病毒NP蛋白的痘病毒载体疫苗，实验结果显示免疫后小鼠不仅能抵御人流感病毒pN2的攻击，还能有效抵御禽流感病毒H5N2的攻击。Dynavax公司[49]利用昆虫杆状病毒系统表达了流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的NP蛋白，将NP蛋白和CpG寡核苷酸佐剂——免疫刺激DNA 序列(immuno-stimulatory DNA sequence, ISS)以混合或偶联等不同方式免疫小鼠，结果发现NP-ISS偶联疫苗对不同亚型pN2流感病毒的交叉保护率达80%左右。这些研究均为基于NP的通用流感疫苗的研发提供了参考。

3结语

近年来流感频频肆虐，严重危害人类健康和公共卫生，流感的防治仍是一个亟待解决的难题。一方面，流感病毒对目前用于治疗的抗病毒药物极易产生耐药性；另一方面，目前获得批准使用的流感疫苗均为季节性流感疫苗，仅对亚型内抗原匹配较好的毒株具有免疫保护作用，疫苗毒株依赖于WHO每年的监测与预测，且生产周期长、成本高，难以应对流感大流行。近年来流感病毒广谱中和抗体的发现、对流感病毒抗原保守区域及细胞免疫机制的深入研究、疫苗免疫策略的优化等均为广谱流感疫苗的研发提供了新思路。目前，基于诱导流感病毒HA广谱中和抗体为目标的疫苗设计初步取得了一些成果，基于NP、M2等内部保守抗原，基于诱发T细胞免疫反应及ADCC效应等策略的疫苗设计也取得了相当大的进展，均在动物实验中显示了一定的交叉保护效果。

上述研究为广谱流感疫苗的研发提供了大量实验资料，但仍存在诸多挑战。流感病毒HA的免疫优势与其高度变异性之间的矛盾仍是疫苗研发中需解决的关键问题。基于广谱中和抗体的疫苗设计还应考虑如何使免疫系统得到更全面、有效、持久的激发；流感病毒内部保守的NP、M2等非中和性抗原属于弱保护性抗原，其诱发的免疫保护效果仍需进一步增强和稳定；联合疫苗采用不同类型的疫苗进行初免和加强，在动物实验中显示了较好效果，但其机制研究需更深入；开发新型生产方式替代鸡胚和添加能提高保护性免疫应答反应的佐剂，也是改进疫苗生产的重要环节，需不断完善。

不管是针对季节性流感还是大流行流感的疫苗，其设计、研发与生产进程都处在快速发展阶段，广谱流感疫苗的研发又一次成为研究热点。随着流感病毒学研究的深入、生物信息学技术的发展、疫苗生产方式的变革，如何将这些研究进展转化为可行的疫苗设计和生产策略，开发对A、B型流感病毒所有亚型均具有交叉保护作用的广谱流感疫苗势在必行。

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Corresponding author. XU Jianqing，E-mail：xujianqing2014@126.com

·综述·

Progress and perspectives of universal influenza vaccine

XIE Xinci, LIU Lu, YUAN Songhua, ZHANG Xiaoyan, XU Jianqing

Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China

Abstract:Influenza virus infections are a major public health concern and cause significant morbidity and mortality worldwide. Prevention of influenza through vaccine development is the most effective management strategy, but it is challenged by the evolution of influenza virus variants that could help viruses evade human immunity. Furthermore, the licensed influenza vaccines only induce strain-specific immunity and cannot provide reliable protection against unexpected pandemics and epidemics caused by antigen drift or shift variants. Therefore, research and development of universal vaccines which induce broad-spectrum immune responses has become a hotspot. The discovery of broadly neutralizing antibodies has provided new insights into vaccine development for the past years, and the lucubration of conserved antigenic regions and the study of cellular immunity and the optimization of vaccine immunization strategy also promote the development of universal influenza vaccine. This review summarizes the encouraging scientific advances in the field with a focus on novel epitope-based approaches in vaccine design.

Key words:Influenza A virus; Universal influenza vaccine; Epitope-based approach; Haemagglutinin; Matrix protein 2

收稿日期：(2015-11-01)

通信作者：徐建青

基金项目：国家自然科学基金(81470094)