转SOS基因高羊茅的耐盐性鉴定

倪　星，秦　楚，平　玲，麻冬梅，许　兴

(1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川　750021； 2.宁夏大学 生命科学学院，宁夏 银川　750021)



转SOS基因高羊茅的耐盐性鉴定

倪星1，秦楚2，平玲1，麻冬梅1，许兴1

(1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川750021； 2.宁夏大学 生命科学学院，宁夏 银川750021)

摘要：试验以转SOS基因的高羊茅和野生型高羊茅为材料，测定其在盐碱胁迫下的叶绿素含量、丙二醛、脯氨酸和抗氧化酶活性指标，并测定种植转基因高羊茅和野生型高羊茅前后土壤的理化性质。结果表明，转基因的高羊茅在盐碱胁迫下，叶绿素的含量、脯氨酸的含量和抗氧化酶的活性均高于野生型，丙二醛含量低于野生型；种植野生型高羊茅和转基因高羊茅后，土壤中的pH、碱化度均逐步降低，且种植转基因高羊茅后土壤中的pH、碱化度降低的幅度更大，说明转基因高羊茅植株的耐盐碱性较好，并且在一定程度上改善了土壤的理化性质。

关键词：高羊茅；转基因；生理生化；土壤理化性质；耐盐性

高羊茅是适应生长在亚热带过渡气候区的一种冷季型草种。因适应于广泛的土壤条件，并具有强的耐旱性和耐盐性的优点，被广泛用于城市的绿化。然而在一些传统灌溉区的盐渍化情况下，高羊茅的生长发育受到影响。土壤盐害对植物的生长发育有着严重的影响，是非生物胁迫的因子之一[1,2]。在全球盐渍化情况日益加剧下，在盐碱地上种植耐盐植物，不仅可以起到保护和美化环境，而且有抑制土壤的返盐现象[3]。随着生物学的不断发展，通过转基因技术将耐盐性基因转入到植株中，从而获得高的耐盐性转基因植株。目前，在草坪草上应用农杆菌介导法等获得耐盐性转基因植株已经有了研究的进展[4,5]，通过转基因技术去提高植株的耐盐性已经成为现在研究的一大热点。耐盐性基因是一种由多基因控制的数量性状，SOS信号通路的活性认为是在细胞水平上排Na+和控制离子平衡的关键机制，SOS(salt overly sensitive)途径的一种重要的生理功能就是植物在盐胁迫下进行离子稳态调节和提高耐钠性。对筛选出的转SOS基因高羊茅株系6-2和6-3进行田间的耐盐性鉴定分析，通过测定相关生理生化和土壤理化性质指标，进一步鉴定所获得的转基因高羊茅的耐盐性。

1材料和方法

1.1试验材料

1.1.1野生型材料材料为高羊茅属的“爱瑞3号” (FestucaarundinaceaArid 3)，爱瑞3号高羊茅的成熟种子来源于宁夏草地研究所。

1.1.2转基因材料由中国农业大学植物生物化学与分子生物学重点实验室构建，在遗传育种技术实验室于-70℃保存备用。采用所建立的农杆菌介导转化体系，首次将耐盐相关拟南芥SOS途径基因(SOS1,SOS2，SOS3和SCaBP8)导入高羊茅品种爱瑞3号的基因组中,经PCR、Southern blotting、RT-PCR分子检测和活体叶片PPT抗性鉴定分析,获得独立来源的转基因植株[6]。

1.2试验地概况

贺兰山农牧场位于宁夏平原西部，处于贺兰山东麓洪积平原与黄河冲积平原的结合部，属温带大陆性干旱、半干旱气候，具有无霜期长(175 d)，有效积温较高(3 278～3 350℃)，光照充足(年均日照时数3 039 h，年太阳总辐射量达145 KJ/cm2)，降水少(200 mm)的气候特点。

在贺兰山农牧场开展试验，种植材料前对土壤0～20 cm的表层土壤进行耙地、耢耱、整地、镇压、铲地等措施，将表层土壤混匀，种植转基因材料和野生型材料，测定土壤的理化性质。贺兰山农牧场为典型的盐碱地，土壤pH为9.29，全盐含量为5.01 g/kg，碱化度为14.91%。

1.3方法

试验采用小区分组，将获得的转基因植株6-2、6-3和野生型植株选取长势一致的株系种植在已经完成耕作并且划分完成小区内。从6～10月，每月采样，从每个小区内取长势相同植株的完全展开叶片，设3次重复，测定材料生理生化指标和土壤理化性质。

1.3.1生理生化指标测定丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法[7]测定；脯氨酸(Pro)采用磺基水杨酸法[8,9]测定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用(NBT)氮蓝四唑比色法[7]测定；过氧化物酶(POD)活性采用邻甲氧基苯酚(即愈创木酚法)[10]测定；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法[11]测定；叶绿素含量用手持叶绿素仪(TYS-A)测定。

1.3.2土壤理化性质的测定水溶性盐总量测定采用电导法测定， pH用1.0 mol/L KCl浸提电位法测定，土壤全氮采用半微量开式法测定，全磷采用HCLO-H2SO4钼锑钪比色法测定，碱解氮采用碱解扩散法测定，速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提钼锑钪比色法测定，速效钾采用NH4OAc浸提火焰光度法测定[12]。

2结果与分析

2.1高羊茅株系的生理生化指标的变化

2.1.1MDA的变化MDA是在逆境胁迫下，植物组织或器官受到损害时，膜脂质受到过氧化作用形成的一种产物，其含量与植物在逆境中受到的胁迫程度有关。MDA含量越高，植株组织或器官受到的损害就越大。因此，常用MDA作为膜质过氧化指标表示植物对逆境条件反应的强弱[13]。6～10月，转基因株系6-2的 MDA含量呈下降趋势，转基因株系6-3株系和野生型对照的MDA含量呈现先上升后下降的趋势，这可能是在盐碱胁迫时，种植在贺兰山农牧场盐碱地上的植物对膜脂过氧化的一种防御反应(图1)。

图1　高羊茅的MDA含量Fig.1　The MDA content of transgenic tall fescue under salt stress

2.1.2Pro含量的变化植物体中游离的Pro含量不多，在逆境条件下(旱、热、冷、冻等)，植物体内Pro的含量显著增加[14]，植物体内Pro含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，Pro含量越多，植物对逆境的抵抗性越大。除了9月，转基因高羊茅6-2和6-3株系的Pro含量显著高于野生型对照的Pro，转基因株系中Pro含量为对照植株的0.65～12.9倍(图2)。

图2　高羊茅的Pro含量Fig.2　The Pro content of transgenic tall fescue under salt stress

2.1.3POD活性变化POD是植物体内普遍存在的一种酶，其环境的变化比较敏感，并且随着盐浓度的升高酶的活性会提高。杨素欣等[15]的研究发现，在盐胁迫下，POD酶活性会升高是清除了活性氧自由基，随着胁迫强度的增加则作为一种分解酶，促进细胞的分解衰老，所以POD可作为组织老化的一种生理指标。6～10月，农牧场所有株系POD活性呈现先上升后下降的趋势。转基因高羊茅6-2和6-3株系的POD活性高于野生型对照植株。转基因株系与野生型对照植株中POD活性差异显著(图3)。

2.1.4SOD活性的变化SOD酶是清除生物体内自由基的重要酶，有清除体内超氧阴离子自由基的生理功能。6～10月，农牧场所有株系SOD活性呈现先上升后下降的趋势，与POD活性的变化趋势一致。8月，所有株系SOD含量达到最大值。除了6月，转基因株系6-2的SOD含量小于野生型，其他月，SOD含量从大到小依次为：6-2>6-3>野生型对照(图4)。

图3　高羊茅的POD活性Fig.3　The POD content of transgenic tall fescue

图4　高羊茅的SOD活性Fig.4　The SOD content of transgenic tall fescue

2.1.5CAT活性的变化CAT是一种抗氧化酶，是在生物进化的过程中产生的生物防御系统的一种关键酶，并且能够催化细胞内的过氧化氢发生歧化反应，所以是生物体内的酶的保护系统的一个重要的因素[16]。由图5可知，6～8月,所有株系CAT活性都呈现上升的趋势，8月，各株系CAT活性达到最高值。9月CAT活性都呈现下降趋势，10月CAT活性又有所增加。转基因高羊茅6-2和6-3株系的POD活性均高于野生型对照植株(图5)。

2.1.6叶绿素含量的变化植株的生长代谢与叶绿素含量有很大的关系。光合作用产生的有机物提供植物的生长，光合作用必须有色素才能进行，大部分叶绿素a和b吸收光能，少量的叶绿素a捕获传递光能，使光合作用进行下去，所以叶绿素的含量越多，植株的生长越旺盛，代谢越强。在农牧场种植的株系在7月叶绿素含量降低，8月叶绿素含量大幅上升，9～10月，叶绿素含量逐渐降低，可能是7月份农牧场的灌水受到限制。转基因株系6-2株系和6-3株系的叶绿素平均含量均大于野生型对照(表5)。

图5　高羊茅的CAT活性Fig.5　The CAT content of transgenic tall fescue

图6　草坪草的叶绿素含量Fig.6　The cholorophyll content of transgenic tall

2.2种植转基因高羊茅的土壤理化性质变化

贺兰山农牧场为典型的盐碱地，土壤pH 9.29，全盐含量为5.01 g/kg，碱化度为14.91%。所有株系土壤pH和全盐含量呈现线下降后上升的趋势，这可能是秋季反盐的原因。转基因株系土壤的pH显著低于野生型，pH呈现为野生型>6-2>6-3，碱化度呈下降趋势(表1)。

3讨论与结论

3.1盐碱地上转基因高羊茅生理生化指标变化

叶绿素作为绿色植物吸收光能，发生光合反应，将光能转换成化学能的一种活性物质，其含量的多少直接影响到植物光合作用，产生有机物能力的强弱[17]。盐胁迫下能破坏植物叶绿体的结构，并且增加叶绿体酶的活性，从而加速叶绿素的分解，导致叶绿素含量降低[18]。转基因株系6-2和6-3株系的叶绿素平均含量整体大于野生型对照。

表1　农牧场转基因高羊茅的土壤pH、全盐及碱化度

盐碱地上种植的植物在受到盐胁迫时，导致植物发生氧化反应，使植物体内产生大量的活性氧和自由基，从而破换植物的细胞膜结构[19]。有研究报道，在盐胁迫下，植物体内的活性氧含量会上升[20]，为了适应盐胁迫产生的氧化伤害,植物体内形成了相应的保护系统来减少或清除活性氧或自由基,缓解氧化胁迫[21]。植物体内的SOD，CAT和POD等保护酶类相互协同作用，共同清除植物体在逆境下产生的过量的活性氧,从而保持活性氧的代谢平衡和膜结构,在一定程度上减缓或抵御逆境胁迫对植物的伤害[22]。SOD更是保护植物细胞免受自由基伤害的第一道防线,其活性的高低反映氧化损伤时植株的修复能力。从试验中发现，农牧场所有株系SOD活性的变化呈现先上升后下降的趋势。SOD平均含量从大到小依次为：6-2>6-3>野生型对照，盐碱胁迫下，高羊茅野生型植株SOD活性降低，而转基因植株叶中的SOD活性则显著升高，转基因株系6-2的SOD活性>6-3。CAT能消除植物体内产生的过多的H2O2,使植物体内H2O2含量维持一个低浓度水平。高羊茅野生型植株叶片的CAT活性相对高,而转基因植株的CAT活性相对低。而植物体内POD是免受H2O2伤害保护细胞的主要酶[23],它在保护细胞免受H2O2胁迫中起重要作用。从试验结果分析，转基因株系与野生型对照中POD活性差异显著，盐碱胁迫显著提高了转基因植株的POD活性，转基因株系6-3和6-2的POD活性大于野生型植株。转SOS途径基因的转基因植株具有较强耐盐碱性的原因之一是增强了耐盐碱修复能力。

Pro是植物在逆境胁迫下产生的一种重要的渗透调节物质。种植在农牧场的转基因高羊茅6-2和6-3株系的脯氨酸含量显著高于野生型对照的脯氨酸含量，这说明在盐碱胁迫条件下，通过积累较多的脯氨酸，转SOS途径基因的转基因植株可以提高植物的耐盐碱能力。

逆境胁迫导致细胞膜脂质过氧化，破坏质膜结构，植物MDA含量高低能够反映质膜破坏程度。转基因株系6-2和6-3与野生型对照相比，在盐碱胁迫下MDA积累较少，说明转基因株系膜脂过氧化程度较低，膜的结构较稳定。

3.2转基因高羊茅对土壤理化性质的影响

对种植转基因高羊茅后的土壤的理化性质方面影响的研究报道较少，多数仅研究土壤肥力。土壤理化性质及结构多数发生变化是由于灌溉、耕作模式等对其产生影响。试验由于导入的SOS基因途径使转基因高羊茅在一定程度上出现了耐盐性，从试验的总体结果分析，农牧场种植的转基因高羊茅和野生型高羊茅的土壤的物理性质发生了一定的变化。通过将种植在相同条件下的转基因高羊茅与野生型植株的种植土壤进行比较，种植转基因高羊茅后能降低土壤 pH、全盐及碱化度，这是由于种植高羊茅后，植株的长势差异而引起的，即达到生物改良的作用[24]。

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Salt tolerance identification of tall fescue transferred SOS pathway genes

NI Xing1,QIN Chu2,PING Ling1,MA Dong-mei1,XU Xing1

(1.CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China； 2.CollegeofLifeScience,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China)

Abstract：The tall fescue transferred SOS gene and wild type plants were used to identify the salt tolorence through measuring the chlorophyll content，MDA，proline，antixidant enzyme activity and physicochemical properties. The results showed that the average chlorophyll content, proline content and antioxidant enzyme activity of the transgenic tall fescue were higher than wild type. However，MDA content was lower. The soil pH，alkalinity all gradually reduced after growing tall fecuse, and the decreasing range for transgenetic tall fescue was greater than wild type. The results suggested that transgenic tall fescue was better in terms of salt tolerance and soil improvement.

Key words：tall fescue;transgenosis;physiology and biochemistry;soil physicochemical properties;salt tolerance

中图分类号：Q 789

文献标识码：A

文章编号：1009-5500(2016)01-0043-05

作者简介：倪星(1991-)，陕西咸阳人，在读硕士研究生。

基金项目：宁夏回族自治区牧草育种专项(NYYZ-2014-Z12)和国家973项目(2012CB114204)资助

收稿日期：2015-08-23； 修回日期：2015-11-27

E-mail：475399935@qq.com

许兴为通讯作者。