重组腺病毒p27kip1诱导脑胶质瘤细胞凋亡的初步研究

蒋福刚　王天易　李　军　熊青荣

解放军第一八一医院　1)神经外科　2)影像中心　桂林　541002



重组腺病毒p27kip1诱导脑胶质瘤细胞凋亡的初步研究

蒋福刚1)王天易1)李军1)熊青荣2)△

解放军第一八一医院1)神经外科2)影像中心桂林541002

【摘要】目的研究重组腺病毒介导的p27kip1体外对U251人胶质瘤细胞凋亡的影响。方法构建p27kip1重组腺病毒载体转染U251人胶质瘤细胞为实验组，并设正常对照组、空载体组，采用Western blot法检测相关蛋白的表达；采用Real time PCR法检测相关基因的表达；采用流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果Western blot 和Real time PCR结果均显示，实验组细胞经转染72 h后，可见Bcl-2表达降低，同时Bax、Caspase3和Fas-L表达增强；流式细胞仪检测转染p27kip1腺病毒后能够抑制胶质瘤细胞的增殖。结论p27kip1在体外能够抑制U251人胶质瘤细胞增殖，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。

【关键词】p27kip1；胶质瘤；腺病毒；细胞凋亡

胶质瘤是最普遍的原发性脑肿瘤，我国胶质瘤的发病率及病死率居世界前列，因此，对脑胶质瘤的研究极为重要。肿瘤的生长、转移与癌细胞的增殖有着密切关系，而许多癌基因和抑癌基因都直接参与了癌细胞的生长[1-2]。因此，研究胶质瘤细胞增殖相关基因至关重要。p27Kip1是1994年发现的一种抑癌基因，有研究表明P27kip1的表达随人脑胶质瘤级别的升高而降低，在胶质瘤的浸润、迁移和肿瘤抑制中可能有调节作用[3-4]。因此，p27kip1表达下调或缺失与胶质瘤的发生有密切关系。本研究用重组腺病毒介导的p27kip1基因，观察对人胶质瘤细胞生长的影响，并初步探讨了p27kip1的抑瘤机制，为临床诊断、治疗提供理论依据。

1材料

U251人胶质瘤细胞购于sigma公司。一抗：小鼠抗人p27kip1、Bcl-2、Bax、Caspase3和Fas-L抗体购于Santa公司，二抗：辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG购于北京中杉金桥ZB-2301。逆转录试剂盒，2×Taq PCR Master Mix，TRNzol总RNA提取试剂盒均购自北京天根。引物均由上海生工生物有限公司合成。LipofectamineTM2000转染试剂盒购于罗氏公司。

2方法

2.1p27kip1过表达腺病毒载体构建根据人p27kip1基因的cDNA片段，设计引物如下：p27kip1-1：5' ggcgctttgttttgttcggtttt 3'；p27kip1-2：5' ccccgctccacgtcagttcct 3' 1006 bp；选取野生型基因组DNA样本，采用高保真酶进行PCR扩增后，连T载体，测序鉴定。将测序正确的模板亚克隆至AdTrack穿梭载体，PmeI线性化后在BJ5183细菌中重组，挑选正确的重组子，大量扩增质粒。包装：采用LipofectamineTM2000转染介导试剂，用PacⅠ酶切后的pAdeasy-Adtrack-p27kip1重组质粒转染293细胞，具体按LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行。

2.2Western blot及Real time PCR法检测转染p27kip1腺病毒对人胶质瘤细胞凋亡相关因子表达的影响(1)细胞处理：实验组：采用LipofectamineTM2000转染介导试剂，用包装好的p27kip1腺病毒转染U251人胶质瘤细胞，具体操作按LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行；空载体组：将pAdeasy-Adtrack空载体按前面方法转染U251人胶质瘤细胞；正常对照组：未转染任何质粒的U251人胶质瘤细胞。各组细胞培养72 h后收集保存。(2)Western blot法：收集细胞加蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA法检测胞总蛋白浓度。取50 μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，13 V(恒压)过夜，将凝胶中蛋白质转移至PVDF膜上。PVDF膜以含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，分别加入小鼠抗人p27kip1、Bcl-2、Bax、Caspase3和Fas-L抗体室温反应2 h，山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育2 h，化学发光显色。用Gel-ProAnalyzer3.2图像分析软件分析条带灰度值。(3)Real time PCR：收集细胞采用异硫氰酸胍/苯酚法提取总RNA(TRNzol总RNA提取试剂盒)，紫外分光光度仪测RNA纯度及浓度。用2 μgRNA样品进行逆转录，加样体系如下：RNA Ace 0.5 μL，RNAase Inhibitor 0.5 μL，Oligo(dt) 1 μL，dNTPs 2 μL，5×RT buffer 4 μL，2 μgRNA，补1‰DEPC水至20 μL；反应条件如下：42 ℃ 10 min，30 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。Real time PCR加样体系如下：2×SYBRGreen10 μL，上下游引物各0.3 μL，cDNA 2 μL，补无菌双蒸水至20 μL。加完样后上荧光定量PCR仪反应。条件如下：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)40 cycles，72 ℃ 10 min。基因引物序列如下(表1)。

表1　基因引物序列

2.3流式细胞仪检测转染p27kip1腺病毒对人胶质瘤细胞周期的影响取对数生长期的SFs(悬浮生长细胞)进行实验。(1)细胞处理及分组:以1×106/mL接种对数生长期经s100A4 siRNA转染的SFs细胞于37 ℃、5% CO2与饱和湿度下培养24 h，与48 h各一组，相同条件下培养未转染细胞作对照。(2)DNA含量分析法：收集细胞，添加适量4 ℃预冷PBS，混匀、1 000 r/min，离心5 min，弃上清，12 mm×75 mm离心管中加0.5 mL PBS重悬细胞，细胞计数具体操：4 ℃预冷70%乙醇固定细胞(1×106)24～72 h；3 500 r/min，离心5 min，弃上清；1 mL PBS重悬细胞，3 500 r/min，离心5 min，弃上清；重复一次；120～150 μL RNAase，37 ℃孵育40 min；150～200 μL PI，4 ℃孵育2 h；上机检测；Modfit LT for Mac。

3结果

3.1PCR扩增目的片段p27kip1见图1。

图1　PCR扩增结果

注：第1泳道为:Maker DL2000， 从上到下 2000、1000、750、500、250、100 bp；第2泳道为: p27kip1目的条带，1 000 bp左右，与预期大小吻合，回收目的条带

3.2 Western blot法检测转染p27kip1腺病毒对人胶质瘤细胞凋亡相关因子蛋白表达的影响Western blot检测显示，与对照组相比，转染p27kip1腺病毒组的Bcl-2蛋白表达有所降低，而BAX、Caspase3和Fas-L蛋白的表达有所升高；转染空载体组蛋白表达无明显差异(图2)。结果说明p27kip1可以促进人胶质瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长。

图2Western blot检测结果

注：上样顺序从左到右分别为：转染p27kip1腺病毒组、空载体组、对照组

3.3Real time PCR法检测转染p27kip1腺病毒对人胶质瘤细胞凋亡相关因子基因表达的影响Real time PCR检测显示，与对照组相比，转染p27kip1腺病毒组的Bcl-2的mRNA相对表达倍数有所降低，而BAX、Caspase3和Fas-L的mRNA相对表达倍数有所升高(表2)；转染空载体组mRNA相对表达倍数无明显差异。p27kip1可以促进人胶质瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长。

表2　Real time PCR检测结果

注：与正常细胞组比，*P<0.05

3.4流式细胞仪检测转染p27kip1腺病毒对人胶质瘤细胞周期的影响见图3、图4。

图3　未转染p27kip1腺病毒的人胶质瘤细胞周期

图4　转染p27kip1腺病毒的人胶质瘤细胞周期

流式细胞检测结果表明，与未转染的人胶质瘤细胞(图3)相比，转染p27kip1腺病毒的人胶质瘤细胞增殖受抑(图4)，说明p27kip1对人胶质瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。

4讨论

由于胶质瘤的侵袭特点，即使采取辅助治疗，复发也很普遍，严重威胁患者的身体健康。靶向治疗正越来越引起注意。真核生物细胞周期的调控有赖于细胞周期素依赖性激酶(CDK)的活性，P27 Kip1蛋白是一种CDK抑制剂，具有限制性调节细胞周期进程的作用[4]。虽然p27Kip1在脑胶质瘤中的抑癌作用和机制仍存在较大争议[5]，但作为细胞分裂周期中的一个非常重要的负性调节物，在研究细胞周期调

控中，p27Kip1越来越受到重视。本研究Western blot和Real time PCR结果显示，在转染了pAdeasy-Adtrack-p27kip1重组质粒的胶质瘤细胞中，细胞周期相关基因Bcl-2表达降低，同时Bax、Caspase3和Fas-L表达增强，说明p27kip1表达的增加对胶质瘤细胞周期受到影响。流式细胞检测结果也显示转染了p27kip1重组质粒的人胶质瘤细胞增殖受到抑制，产生细胞凋亡现象。这一结果也与赵斌杰等[6]研究相似，表明p27kip1的表达对星形胶质瘤增生活性起抑制作用。故对p27kip1基因的深入研究和深入探讨在胶质瘤的防治方面具有重要意义。

5参考文献

[1]Nagane M.Anti-angioenic therapy for malignant glioma[J].Gan To Kagaku Ryoho，2014，41(2):141-147.

[2]Wang L，Zhang B，Xu X，et al.Clinical significance of FOXP3 expression in human gliomas[J].Clin Transl Oncol，2014，16(1):36-43.

[3]高宝莲，王东林.人脑胶质瘤中EGFR和P27kip1表达及其意义[J].肿瘤学杂志，2010，16(1):50-52.

[4]Sherr CJ.Cancer cell cycles[J].Science，1996，274:1 672.

[5]Zagzag D，Blanco C，Friedlander DR，et al.Expression of P27kip1 in human gliomas:relationship between tumor grade，proliferation index，and patient survival[J].Hum Pathol，2003，34(1):48-53.

[6]赵斌杰，赵洪洋，戢翰升，等.重组腺病毒介导的P27kip1基因治疗大鼠神经胶质瘤的实验研究[J].中国临床神经外科杂志，2006，(3):160-163.

(收稿2015-05-11)

【中图分类号】R730.264

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)05-0027-03

通讯作者：△熊青荣，E-mail:yibayi@sina.com