通络救脑注射液对大鼠脑缺血/再灌注神经保护作用的研究

康　康　冀书娟　梅海云

河南信阳市中心医院神经内科　信阳　464000



通络救脑注射液对大鼠脑缺血/再灌注神经保护作用的研究

康康冀书娟梅海云

河南信阳市中心医院神经内科信阳464000

【摘要】目的观察通络救脑注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法参照Longa法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。实验大鼠随机分为假手术组、模型组、通络救脑组。于脑缺血/再灌注24 h进行行为学评分，HE染色法检测脑组织病理变化，并且检测大鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)活性的变化，Western blot检测NF-κB的表达结果。结果与模型组相比，通络救脑注射液能明显改善大鼠神经行为，减轻脑组织病理改变，降低MDA含量，明显升高SOD、GSH活性，下调NF-κB表达。结论通络救脑对大鼠脑缺血再灌注损伤神经有保护作用，其作用机制可能为抑制氧化损伤和炎症。

【关键词】通络救脑；脑缺血再灌注；HE染色；蛋白质印迹；神经保护

通络救脑注射液具有清热解毒活血作用，适用于治疗缺血性脑病，其处方组成为栀子苷和三七总皂苷[1]。现代药理学研究表明，通络救脑具有改善学习记忆[1-3]、保护血管[4]、促进神经细胞突触可塑性[5]等广泛药理作用，并能透过血脑屏障，故临床上可用于防治神经障碍、缺血性脑病及老年性痴呆。脑缺血/再灌注时通常会引起神经细胞损伤，究其原因与氧自由基过度释放、炎症反应等紧密相关[6]。当自由基的产生远超机体自身的清除能力时，会造成自由基蓄积，损害血管内皮、破坏细胞膜及细胞器中的不饱和脂肪酸，进而损伤神经组织。此外中枢神经系统的过度炎症反应除了影响局部血流供应，还会直接破坏组织结构，而肿瘤坏死因子及白介素-6等炎性介质的释放会进一步加重血脑屏障的破坏，从而使缺血损伤放大，加重神经功能损伤。本文采用经典的线栓法制备脑缺血/再灌注损伤大鼠模型，研究通络救脑对病理大鼠的保护作用，并初步探讨其作用机制。

1材料

1.1实验动物 PF级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量282～326 g，实验动物购自北京大学医学部动物实验中心(动物许可证号：SCXK(京)2006-0008)。

1.2药物与试剂络救脑注射液(天津红日药业有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，谷胱甘肽(GSH)试剂盒由碧云天生物技术研究所提供。

1.3仪器温超速离心机，电子天平。

2方法

2.1实验分组与给药成年健康雄性Wistar大鼠60只，按体质量随机分为3组，每组20只。假手术组：腹腔注射生理盐水；脑缺血/再灌注模型组：腹腔注射生理盐水；通络救脑注射液组：预处理14 d，腹腔注射通络救脑(50 mg/kg)。实验大鼠手术前1 d禁食禁水。

2.2脑缺血再灌注模型制备 采用Longa法[7]制备局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(剂量300 mg/kg)，麻醉后仰卧位固定，于颈正中切口，分离皮下组织、肌肉，继续分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，结扎颈外动脉后在颈总动脉作一切口，插入线栓，向颅内方向推进约18 mm，此时大鼠中动脉被阻塞并导致脑缺血。结扎入口处，缝合，2 h后拔出线栓进行再灌注。

2.3大鼠行为障碍评分 按Longa评分法，分别于术后24、72 h对实验大鼠进行神经功能评分，标准如下：0分症状最轻，未见明显异常；1分为脑缺血/再灌注部位对侧前爪不能完全伸直；2分为实验大鼠向脑损伤部位对侧转圈，属中度灶性神经缺陷；3分为大鼠向脑损伤对侧倾倒，属严重局灶性神经缺陷；不能自发行走，意识昏迷者记4分[7]。

2.4生化指标评测待行为学评分试验结束后，每组取8只大鼠，断头、取脑，脑组织加适量生理盐水制成1%的匀浆液，3 500 r/min离心10 min后，取上清液，测定蛋白浓度，总蛋白含量采用BCA蛋白试剂盒测定；SOD、GSH和MDA含量按照各自说明书进行。

2.5组织病理学分析各实验组分别随机选取6只大鼠，断头处死后取脑，福尔马林固定，7 d后脱水、包埋、切片及HE染色。光镜下观察脑组织的结构变化[8]。

2.6NF-κB检测取脑组织，加4倍裂解液(v/w)制成匀浆，Western blot检测含量。

2.7统计学处理 统计学分析采用SPSS 13.0软件，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，计数资料以率(%)表示，采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1对脑缺血/再灌注大鼠神经症状的影响 脑缺血/再灌注模型组大鼠出现行走时步态不稳且向左侧倾斜、提尾悬空左前肢内收等明显的神经症状。术后48、72 h评分中，由表1可知，通络救脑组与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。通络救脑注射液能不同程度地改善脑缺血/再灌注损伤大鼠的行为障碍，对脑缺血模型大鼠的神经功能具有一定的保护作用。

表1　脑缺血再灌注大鼠神经功能评分　±s，n=12)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△△P<0.01

3.2生化评价结果由图2可知，模型组大鼠SOD、GSH活性均比假手术组大鼠明显降低，MDA含量却升高。通络救脑组能明显提高SOD、GSH活性，降低MDA含量，说明药物可以在一定程度上降低脑缺血/再灌注模型大鼠的氧化损伤。

表2　通络救脑注射液对脑缺血/再灌注损伤大鼠血清中

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△P<0.05，△△P<0.01

3.3HE染色结果在光镜下观察可见假手术组大鼠脑组织结构正常，胞质丰富，神经细胞外形规则、排列整齐，核仁清晰可见。模型组缺血侧神经细胞变性，周围间隙增宽，部分结构不清，胞体缩小。与模型组相比，通络救脑能明显减轻上述病理改变，神经细胞结构改变减轻，结果见图1。

图1　HE染色结果(×400)　A假手术组　B模型组　C通络救脑组

3.4Western blot检测结果结果发现模型组大鼠NF-κB的表达(0.964±0.23)高于假手术组(0.716±0.15)，差异具有统计学意义(P<0.01)；而通络救脑组大鼠NF-κB的表达(0.864±0.18)低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2　通络救脑对脑缺血再灌注大鼠NF-κB 表达的影响

4讨论

脑组织对缺氧高度敏感，脑缺血再灌注时，缺血区神经细胞坏死，造成蛋白水解酶及活性氧(ROS)等物质释放，从而引发局部炎症反应[8]。此外，氧化应激会造成缺血后的神经元损伤，加速脂质过氧化，从而改变脑内的抗氧化体系。MDA是氧自由基发生脂质过氧化反应后的代谢物，反映机体的脂质过氧化程度，其含量高低能说明机体受自由基攻击的严重程度；SOD、GSH则为自由基清除剂，能够清除自由基，对机体具有保护作用，其活性越高，说明机体清除自由基能力越强。研究发现，大鼠在脑缺血/再灌注后，神经功能会出现不同程度损伤，甚至有脑梗死出现，而通络救脑注射液能降低神经功能障碍的发生率、改善大鼠皮层神经元核固缩、减轻运动障碍；此外，通络救脑注射液能提高SOD、GSH活性，降低MDA含量。本实验观察到通络救脑注射液通过抗氧化作用从而减少氧化损伤和神经元缺失，说明其具有神经保护作用。

有研究表明，脑缺血时NF-κB活化，加速细胞死亡、加速炎症反应，采用降低其活性的措施则会缩小脑梗死体积[9]。本实验中，模型组大鼠在脑缺血再灌注初期时，新皮质NF-κB活性已升高，并随时间的延长快速升高，NF-κB的活化又进一步增大了脑梗死体积。采用通络救脑注射液后，能降低NF-κB活性，从而对脑缺血再灌注起到保护作用。

5参考文献

[1]刘洋，李澎涛，刘希伟，等.通络救脑注射液对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆及氧化应激反应的影响[J].中医学报，2012，27(12):1 614-1 616.

[2]董海影，张春庆，宫国良，等.通络救脑口服液对AD大鼠学习记忆能力及nNOS、SS表达的影响[J].时珍国医国药，2010，21(10):2 542-2 544.

[3]张晓杰，牛英才，兴桂华，等.通络救脑口服液对AD大鼠学习记忆能力及AChE表达的影响[J].中华中医药杂志，2007，22(6):410-413.

[4]郭晓谨，周梦佳，李峰，等.通络救脑注射液及其有效组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞BDNF表达的影响[J].中国中医基础医学杂志，2014，20(8):1 065-1 066.

[5]陈金燕，陈文举，李娇，等.复方通络救脑促进神经细胞突触可塑性[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(7):164-167.

[6]Choi YK，Cho G，Hwang S，et al.Methyleugenol reduces cerebral ischemic injury by suppression of oxidative injury and inflammation[J].Free Radical Research，2010，44(8):925-35.

[7]hu X，Zhou X， He B，et al. Minocycline protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high mobility group box 1 protein in rats[J].European journal of pharmacology，2010，638(1):84-89.

[8]陶莉，望运玲，武双婵，等.丁香酚对大鼠局灶性脑缺血/再灌注神经保护作用的研究[J].中国药理学通报，2013，29(8)：1 146-1 150.

[9]Zheng Z，Yenari MA.Post-ischemic inflammation:molecular mechanisms and the rapeutic implications[J].Neurol Res，2004，26(8):884-892.

(收稿2015-04-20)

【中图分类号】R743

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)05-0057-03