H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

邓显文 谢芝勋 谢志勤 刘加波 庞耀珊 谢丽基 范晴 罗思思 黄莉 黄娇玲 曾婷婷 张芳

摘要：【目的】制备H9亚型禽流感病毒（AIV）血凝素（HA）单克隆抗体，为检测诊断AIV提供技术支持。【方法】以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原，免疫6～8周BALB/c雌性小鼠，然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经血凝抑制试验（HI）及间接免疫荧光试验（IFA）筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。【结果】经过4次亚克隆，获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株，其细胞株培养上清液HI效价为27～210，腹水HI效价为216～219；单克隆抗体亚类鉴定结果表明，3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类，其轻链均为K链。3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应，而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒（NDV）、减蛋综合症病毒（EDS）、传染性支气管炎病毒（IBV）无交叉反应。3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好。【结论】用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体，且具有良好的亚型广谱性和特异性。

关键词： 禽流感病毒（AIV）；H9亚型；血凝素；单克隆抗体；HI效价；亚型广谱性

中图分类号： S852.659.5 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）04-0679-05

0 引言

【研究意义】禽流感（Avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）感染禽类引起的一类传染病（殷震和刘景华，1997），在我国广泛存在，且近年来危害越来越严重，给我国造成至少600亿元的经济损失（沙爱龙和刘泽隆，2007），其中2014年发生高致病性AI（H5N1亚型），累计发病家禽5.1万羽，销毁525.0万羽（孙洪涛等，2015），甚至威胁到人类公共卫生（王秀荣和陈化兰，2005）。因此，加强AIV研究及建立快速准确的诊断方法已成为AI防控工作的热点和重点。【前人研究进展】单克隆抗体因具有单一抗原决定簇的特异性，且效价高、理化性状均一、重复性强、生产成本低，已被广泛应用于病毒学诊断（刘萍等，2012；祭芳等，2014）。李长瑜等（2007）用胶体金标记提纯的小鹅瘟病毒（Goose plaguo virus，GPV）单克隆抗体2B8并制备金标棉，以马抗GPV多克隆抗体和羊抗鼠抗体喷涂NC膜，组装获得只能检测出GPV的胶体金检测卡；张祥斌等（2008）制备获得的猪流感病毒（SIV）单克隆抗体（F6A4C10）与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性，为H1N1亚型SIV的鉴别诊断奠定了基础；谢志勤等（2012）通过克隆筛选成功获得2株能稳定传代并分泌抗禽呼肠孤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株（SF6-3K3和SB2-1K3），间接ELISA测定效价在105以上，具有良好的特异性，可用于禽呼肠孤病毒的特异性检测；曹丙蕾等（2014）通过原核表达获得了能与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）N蛋白发生特异性反应的单克隆抗体（6D10和3H5），能有效检测到PRRSV经典毒株和高致病性变异毒株。目前，国内外己有制备AIV单克隆抗体并用于快速诊断的研究报道（孙林等，2010；杨霞等，2011；崔佳莹等，2011），且效果显著。此外，单克隆抗体在动物产品药物残留检测技术方面也得到推广应用，并研制出兽药残留ELISA检测试剂盒，其中一些已实现产业化，取得了顯著的经济效益和社会效益（李晓莉等，2009；李秀婷等，2009）。【本研究切入点】AIV血凝素（Hemagglutinin，HA）直接参与AIV的致病过程，其编码基因点的突变引起抗原变异，因此制备出针对不同亚型AIV的血凝素单克隆抗体，可为研发AIV检测试剂盒奠定基础，但至今鲜见有关H9亚型AIV血凝素单克隆抗体制备及鉴定的研究报道。【拟解决的关键问题】以H9亚型AIV广西分离株为抗原免疫BALB/c，采用杂交瘤技术制备特异的H9亚型AIV血凝素单克隆抗体，为检测诊断AIV提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

AIV广西分离株[A-chicken-Guangxi-LS-2013（H9N2）]、SP2/0骨髓瘤细胞、新城疫病毒（NDV）、减蛋综合症病毒（EDS）和传染性支气管炎病毒（IBV）由广西畜禽疫苗新技术重点实验室保存提供；6～8周SPF级BALB/c雌性小鼠购自广西医科大学实验动物中心；灭活剂β-丙内醋、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、秋水仙素、HT培养基、HAT选择培养基、PEG（MW-4000）融合试剂和鼠源MAb亚类鉴定试剂盒均购自Sigma公司；胎牛血清购自Invitrogen公司；DMEM培养基购自Hycon公司；96孔酶标板、BSA及四甲基联苯胺（TMB）、HRP和FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自深圳晶美生物工程有限公司。

1. 2 单克隆抗体制备

1. 2. 1 动物免疫及单克隆抗体制备 用β-丙内醋灭活已浓缩纯化的AIV广西分离株作为免疫抗原，首免用弗氏完全佐剂等体积乳化，多点皮下注射免疫6～8周BALB/c雌性小鼠；以弗氏不完全佐剂乳化病毒在首免后第21和35 d进行加强免疫；最后一次免疫是在细胞融合前3 d尾静脉采血测定抗体效价，选抗体效价高的小鼠经腹腔注射加强免疫。无菌取免疫小鼠脾脏与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合试验。

1. 2. 2 单克隆抗体检测方法的建立 在细胞融合第9、12和15 d分别取融合细胞上清液，以4 U的AIV广西分离株作检测抗原，采用血凝抑制试验（HI）检测融合细胞上清液。同时以4 U的AIV广西分离株作包被抗原，以SP2/0骨髓瘤细胞培养上清作阴性对照，免疫小鼠阳性血清作阳性对照，建立间接ELISA对融合细胞上清液进行检测筛选。

1. 2. 3 腹水制备 用0.5 mL灭菌白油腹腔注射小鼠，7 d后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10 d后可产生腹水，待腹水尽可能多时收集腹水。

1. 3 单克隆抗体鉴定

1. 3. 1 杂交瘤细胞染色体鉴定 收集培养3～4 d的杂交瘤细胞，加入0.04～0.06 mg/mL秋水仙素，移入新瓶继续培养6～10 h。收集细胞，用氯化钾溶液进行低渗处理，离心收集细胞后用新配制的甲醇—冰乙酸固定液固定，离心收集细胞，滴片后以姬姆萨染色，镜检观察计数，并对杂交瘤细胞染色体组型进行分析。

1. 3. 2 单克隆抗体亚类鉴定 取3株H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞上清液，按照鼠源MAb亚类鉴定试剂盒说明对其进行亚类鉴定。

1. 3. 3 杂交瘤细胞稳定性检测 在液氮中冷冻保存后第3和第6个月分别复苏杂交瘤细胞，收集上清液，用HI及间接ELISA检测上清液中的H9单克隆抗体效价，测定H9单抗杂交瘤细胞的抗体分泌能力。

1. 3. 4 抗体效价测定 以HI测定培养上清液和腹水的H9单克隆抗体效价。

1. 3. 5 单克隆抗体广谱性检测 将H9单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清液分别与H9亚型不同病毒分离株进行HI试验，检测其广谱性。

1. 3. 6 单克隆抗体特异性检测 取H9单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清液分别与不同亚型AIV毒株及NDV、EDS和IBV进行HI试验，检测其特异性。

1. 3. 7 间接免疫荧光试验（IFA） 按1∶100稀释AIV广西分离株，然后接种于48孔细胞培养板中的MDCK细胞（史爱华等，2011）， 感染1.5 h后用PBS冲洗，加入胰酶于37 ℃培养48.0 h，用冰预冷甲醇固定细胞，分别以8A4、1B11和7F1株杂交瘤细胞培养上清液作一抗，以FITC标记羊抗鼠IgG作二抗，同时设阴性对照组，荧光显微镜下观察摄影。

2 结果与分析

2. 1 单克隆抗体制备及阳性细胞株建立

经过细胞融合，采用HI检测细胞上清液，结果筛选得到4株阳性杂交瘤细胞，经过4次亚克隆，同时用间接ELISA检测，最后获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株。

2. 2 单克隆抗体细胞株染色体鉴定结果

采用秋水仙素对3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株进行染色体鉴定，结果发现8A4、1B11和7F1细胞株的染色体数分别为106、109和104，说明3株杂交瘤细胞为骨髓瘤细胞与脾细胞的融合细胞（图1）。

2. 3 单克隆抗体亚类鉴定结果

用鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对8A4、1B11和7F1细胞株进行亚类鉴定，结果发现3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类，其轻链均为K链（表1）。

2. 4 血凝抑制效价结果

H9单克隆抗体8A4、1B11和7F1细胞株培养上清液的HI效价分别为29、210和27，腹水HI效价分别为217、219和216。说明用腹水制备的H9单克隆抗体HI效价非常高，符合单克隆抗体制备的要求。

2. 5 单克隆抗体广谱性检测结果

将8A4、1B11和7F1细胞株培养上清液分别与20株H9亚型AIV进行HI试验，结果发现，3株H9单克隆抗体能与18株H9亚型AIV产生良好反应，仅有2株鸟类H9亚型AIV反应较差（表2），说明3株H9单克隆抗体与H9亞型AIV均能结合，具有较好的广谱性。

2. 6 单克隆抗体特异性检测结果

以制备获得的3株H9单克隆抗体与15株不同亚型AIV及NDV、EDS、IBV进行HI试验，结果表明， 3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV产生良好反应，而与其他亚型AIV及NDV、EDS、IBV无交叉反应，说明制备获得的3株H9单克隆抗体具有良好的特异性（表3）。

2. 7 单克隆抗体稳定性试验结果

分别在液氮冷冻保存第3和第6个月复苏杂交瘤细胞，用HI检测上清液中的H9单克隆抗体效价，结果显示，其HI效价分别由29、210和27下降至28、29和26，说明3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好。

2. 8 间接免疫荧光试验结果

由图2可以看出，制备获得的3株H9单克隆抗体均能与感染H9亚型AIV的MDCK细胞发生特异性结合，荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光，而未感染病毒的MDCK细胞未见绿色荧光。

3 讨论

防控AI的关键技术是建立快速的AIV诊断方法。常规的病毒分离鉴定诊断周期长，HI试验虽然普遍应用，但多抗血清的制备繁琐，且不同批次的质量差异较明显，其特异性和敏感性较差，批间检测结果差异大（闫海滨等，2014）。目前，在各类疾病的病原检测诊断中，单克隆抗体以其特异性高、敏感性强已被广泛应用。詹爱军等（2008）、孙林等（2010）先后制备获得H9亚型AIV血凝素单克隆抗体，能与H9亚型AIV发生特异的HI反应，为AI快速诊断及AIV的抗原性分析等奠定了基础。本研究以灭活的H9亚型AIV广西分离株免疫BALB/c雌性小鼠，成功研制出3株H9亚型AIV血凝素蛋白的单克隆抗体，特异性检测结果表明，制备获得的3株H9单克隆抗体均保持了自然状态下完整的抗原表位，具有很好的H9亚型特异性，与崔佳莹等（2011）采用GD261分离株制备H5亚型AIV血凝素单克隆抗体的研究结果一致，只是亚型不同。

AIV亚型众多，且在同亚型内还包含有许多毒株，其抗原性存在较大差异。因此，制备的单克隆抗体必须进行型特异性检测和同型的排谱反应。本研究对制备获得的3株H9亚型单克隆抗体进行广谱性检测，结果发现其均具有良好的HI反应，只有2株从鸟类分离获得的H9亚型AIV（5300035B-8和5300035B-15）反应较差，说明从鸟类分离获得的H9亚型AIV血凝素蛋白抗原发生了变异。这对AIV病原学诊断研究及防控H9亚型AI具有重要意义。

4 结论

用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体，且具有良好的亚型广谱性和特异性。

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（責任编辑 兰宗宝）