舍曲林对缺血性脑卒中后抑郁模型大鼠海马TrkB和CREB表达的影响

郑永丽，王昊亮，李文强，王旭生，宋景贵



舍曲林对缺血性脑卒中后抑郁模型大鼠海马TrkB和CREB表达的影响

郑永丽，王昊亮，李文强，王旭生，宋景贵

目的观察舍曲林对缺血性脑卒中后抑郁模型大鼠行为学的影响，以及该模型大鼠海马酪氨酸激酶受体B(TrkB)和cAMP反应原件连接蛋白(CREB)表达的影响。方法将40只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、抑郁组、PSD组和舍曲林预防组，每组10只。采用改良双侧颈总动脉结扎术制备全脑缺血大鼠模型，慢性不可预见性温和刺激和孤养法制备抑郁大鼠模型，将以上方法相结合制备PSD大鼠模型。舍曲林预防组予舍曲林水溶液 [1 mg/(100g·d)]对制备的PSD大鼠每天灌胃1次。观察各组大鼠自发性行为学改变，采用蔗糖水消耗试验、旷场试验、体重变化评定大鼠的行为学变化；21 d后采用免疫组织化学法分析大鼠海马TrkB、CREB蛋白的表达。结果应激开始后第7 d、第14 d、第21 d测大鼠体重、蔗糖水饮用量、旷场试验水平运动距离，PSD组较假手术组差异有统计学意义(P<0.01)，预防组较PSD组差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组化结果显示，PSD组大鼠模型海马各区TrkB、CREB的平均光密度值均明显低于假手术组(P<0.01，P<0.05)，舍曲林预防组大鼠模型海马各区TrkB、CREB的平均光密度值明显高于PSD组(P<0.01)。结论舍曲林可有效改善PSD大鼠的抑郁状况，TrkB、CREB参与此过程并起着重要作用。

舍曲林；卒中后抑郁；酪氨酸激酶受体B；cAMP反应原件连接蛋白

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是脑卒中患者最为常见的并发症之一，主要表现为情绪低落、兴趣下降和睡眠障碍等，其发病率占脑卒中患者的20%～79%，严重影响患者的生存质量和转归[1，2]。近年来研究发现BDNF-TrkB-CREB通路与卒中后抑郁发生有密切关系[3，4]。酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)为脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的受体之一，环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)为信号转导通路一个关键的调节子，它们表达的变化有可能通过改变BDNF-TrkB-CREB通路从而影响PSD的发生。在对抗抑郁药物作用机制方面的研究中，Mi等通过体外实验证实各种选择性5-HT再摄入抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)可通过调节突触蛋白水平和海马树突的生长来调控突触的可塑性；SSRIs是通过BDNF-TrkB-CREB通路来完成这一生理过程的[5]。舍曲林是SSRIs的经典代表药物，具有高选择性、高安全性等特点，被广泛应用于临床。本实验通过建立缺血性脑卒中大鼠模型，应用舍曲林药物预防治疗，通过观察大鼠行为学的改变以及海马区TrkB、CREB的表达改变，探讨舍曲林对缺血性脑卒中大鼠抑郁发生的影响并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物SD大鼠40只，清洁级，雄性，体重(230.0±20.0)g，由郑州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。

1.2实验仪器和试剂旷场箱(100 cm×100 cm×40 cm)(深圳市沃瑞德生命科技有限公司)；CM1850冰冻切片机(德国Leica)；DM2000图像采集与分析系统(德国Leica)；舍曲林(天津华津制药有限公司)；Rabbit Anti-CREB-1 antibody (bs-0035R)(北京博奥森生物技术有限公司)；Rabbit Anti-TrkB antibody (bs-0288R)(北京博奥森生物技术有限公司)；SP-9001兔SP检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；浓缩型DAB试剂盒(20×)(ZLI-9018)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3分组首先进行蔗糖水消耗试验和旷场实验(open-field test，OFT)，并进行行为学评分。测出蔗糖水消耗试验和OFT的基线值，从中筛选出得分均一的大鼠，随机分为假手术组、抑郁组、PSD组及舍曲林预防组，每组10只。假手术组：对实验大鼠行假手术，术后7 d每天进行生理盐水灌胃21 d；抑郁组：对实验大鼠行假手术，术后7 d行慢性不可预见性温和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，参考Jindal等[6]方法并加以改进，同时每天进行生理盐水灌胃21 d；PSD组：对实验大鼠行改良双侧颈总动脉结扎术[7]，术后7 d行CUMS并同时每天进行生理盐水灌胃21 d；舍曲林预防组：对实验大鼠行改良双侧颈总动脉结扎术，术后7 d行CUMS并同时每天进行舍曲林水溶液[1 mg/(100g·d)]灌胃21 d。

1.4行为学观察每天观察各组大鼠的进食、饮水情况，大便状况以及精神状况，并在大鼠术前1 d、应激开始后7 d、14 d、21 d记录各组大鼠的体重，并进行蔗糖水消耗试验，记录各组大鼠1 h的饮水量，并计算出各组大鼠蔗糖水饮用量(g/100 g)=1 h饮水量/动物体重×100；进行OFT记录各组大鼠5 min内的水平运动距离。

1.5免疫组织化学方法检测各组大鼠海马区TrkB和CREB含量的测定在实验最后一次行为学评估后，所有大鼠给予10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射进行麻醉，打开胸腔暴露心脏，灌注生理盐水，待流出液体变为无色时换为4%多聚甲醛灌注，注意先快后慢，待大鼠四肢肌肉不停抽搐即可停止灌注。灌注后断头取脑，4%多聚甲醛固定过夜，再经蔗糖水溶液梯度脱水，OCT包埋剂包埋，-70 ℃冰冻保存，冰冻切片机-20 ℃进行切片，按照免疫组化SP-9001兔SP及缩型DAB试剂盒说明进行操作。免疫组化结束后，通过DM2000图像采集与分析系统采集图片，运用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定每张免疫组化图片中海马TrkB与CREB阳性染色的平均光密度值，取同一个脑组织3张图片的平均值对其表达进行定量分析。

2　结　果

2.1各组大鼠体重变化与假手术组相比，PSD组和抑郁组大鼠体重增长速度缓慢，舍曲林预防组体重逐渐明显增加(见表1)。

2.2各组大鼠蔗糖水饮用量变化与假手术组相比，PSD组和抑郁组大鼠蔗糖水饮用量明显降低，舍曲林预防组大鼠蔗糖水饮用量逐渐增加(见表2)。

2.3OFT大鼠水平运动变化PSD组和抑郁组大鼠OFT的水平运动距离均明显低于假手术组，舍曲林预防组大鼠OFT的水平运动距离明显高于PSD组(见表3)。

2.4各组大鼠海马各区TrkB蛋白的表达PSD组和抑郁组大鼠海马各区TrkB的平均光密度值均低于假手术组，舍曲林预防组TrkB的平均光密度值高于PSD组(见表4)。

2.5各组大鼠海马各区CREB蛋白的表达PSD组和抑郁组模型大鼠海马各区CREB的平均光密度值均低于假手术组，舍曲林预防组CREB的平均光密度值均高于PSD组(见表5)。

表1　各组大鼠体重变化情况±s，g)

与假手术组相比aP<0.01，与假手术组相比bP<0.05，与PSD组相比cP<0.01

表2　各组大鼠蔗糖水饮用量情况

与假手术组相比aP<0.01；与PSD组相比bP<0.01

表3　OFT水平运动测定

与假手术组相比aP<0.01；与PSD组相比bP<0.01

表4　大鼠海马各区TrkB阳性染色平均光密度值±s)

与假手术组相比aP<0.01，与PSD组相比bP<0.01

表5　大鼠海马各区CREB阳性染色平均光密度值±s)

与假手术组相比aP<0.01，与假手术组相比bP<0.05，与PSD组相比cP<0.01

3　讨　论

该实验采用改良双侧颈总动脉结扎术建立全脑缺血大鼠模型[7]，并在此模型基础上结合孤养法、CUMS[6]和舍曲林水溶液灌胃以模仿PSD的预防治疗。本研究动态行为学评估显示：通过舍曲林预防治疗能够有效改善大鼠的抑郁情绪、活动能力。舍曲林为选择性5-HT再摄取抑制剂，有研究证明，抑郁的神经生物学变化主要为大脑5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素等递质功能紊乱[8]，SSRIs即是通过阻断5-HT的再摄取以提高突触间隙5-HT浓度以起到抗抑郁作用。

在免疫组化结果分析中，PSD组海马区的TrkB、CREB的光密度值明显下降，这与相关研究结果较为一致[4，9，10]，舍曲林预防组海马区TrkB、CREB的光密度值明显提高，基本达到正常，可见TrkB、CREB含量的变化与抑郁行为的出现有一定的关联。

近年来神经营养因子学说渐受到人们的重视，BDNF是一种脑内含量最丰富的神经营养因子[11]，通过增强突触可塑性[12，13]、促进神经发生发挥神经保护作用，通过促进多巴胺能及5-羟色胺能神经元的生存发挥抗抑郁作用[14]。TrkB为BDNF的高亲和力受体，已知神经营养因子要发挥作用，首先得与其受体结合，依次引起一系列的生化反应，启动细胞内信号转导途径，CREB为信号转导通路一个关键的调节子。它们表达的变化有可能通过改变BDNF-TrkB-CREB通路从而影响PSD的发生。

动物实验研究发现向海马内注入外源性BDNF可改善抑郁样行为，且可增加海马内TrkB和CREB的总量[15]。研究证实舍曲林上调大脑海马BDNF[16]，且SSRIs最有可能通过增加神经营养因子如BDNF的表达刺激突触可塑性和神经发生从而发挥抗抑郁作用[17]。因此，本实验研究显示经过21 d舍曲林预防治疗后，PSD大鼠的抑郁样行为和海马区TrkB、CREB的含量水平都得以改善，可能是由于使用SSRI类代表药物舍曲林作用于PSD大鼠，上调海马BDNF的表达，能够增长TrkB的水平，BDNF与TrkB特异性结合发挥生物学效应，如促进神经元修复与再生、并通过调节突触的可塑性促进轴突之间的连接，与此同时激活CREB相关通路，CREB作为通路上重要的转录因子增强BDNF转录进一步预防PSD的发生。且有研究发现在应激抑郁大鼠的海马中BDNF、TrkB、pCREB表达减少，通过激活5-HT1A受体，可以增加它们的表达，从而也减轻了抑郁症状[18]，有力支持了本实验的研究推断。

综上所述，对缺血性脑卒中大鼠应用舍曲林可增加TrkB与CREB的表达从而有效预防PSD的发生，TrkB与CREB有可能参与抑郁症状的发生，参与PSD的药物预防的生物学机制。

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Effects of sertraline on the expression of TrkB and CREB in ischemic post-stroke depression rats

ZHENGYongli，WANGHaoliang，LIWengqiang，etal.

(TheSecongAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453002，China)

ObjectiveTo observe the effects of sertraline on the behavior in ischemic post-stroke depression rats，and the expression of TrkB and CREB in hippocampus. Methods40 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，simple depression group，post-stroke depression (PSD) group and sertraline prevention group (n=10 each). The complete cerebral ischemic rat models were established with reformed occluding the bilateral carotid artery method；applying chronic unpredictable mild stimulation and isolation feed were used to make the rat depression model：the combination of the above methods were taken to induce rat PSD model；sertraline prevention models of rats were induced by subcutaneous gavaged with 1 mg/100(g. d) sertraline. The changes in spontaneous behavior of rats were observed，the changes of behavior in rats were evaluated by sucrose water consumption，open field test and weight changes，and the changes of tyrosine kinase receptor B (TrkB)，cAMP response element binding protein (CREB) of hippocampus were measured by immunohistochemistry after 21days. ResultsThe rat body weight，sucrose water consumption，open field test horizontal movement distance on the 7th，14th，21th were measured after CUMS，the PSD group compared with the control group，the differences had statistical significance (P<0.01)；the sertraline prevention group compared with the PSD group，the differences had statistical significance (P<0.01). The results of immunohistochemistry showed that the average optical density value of both the TrkB and CREB in the rat hippocampus each area of the PSD group decreased significantly compared with control group(P<0.01 orP<0.05)，and those of sertraline prevention group increased clearly compared with the PSD group(P<0.01). ConclusionSertraline may effectively improve PSD rat depression behavior，TrkB and CREB are involved in this process，and play an important role.

Sertraline；Post-stroke depression；Tyrosine kinase receptor B；cAMP response element binding protein

1003-2754(2016)07-0592-04

2016-01-10；

2016-04-30

国家自然科学基金项目(No. 81471349)

(新乡医学院第二附属医院，河南 新乡 453002)

宋景贵，E-mail：songjg62@126.com

R743.3

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