响应面法优化酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的研究

曾健辉， 朱宝君， 王　娟， 孔繁茂， 马广智，3*， 黄儒强*

(1.华南师范大学生命科学学院，广州 510631；2.华南理工大学食品科学与工程学院，广州 510600；3.广东科学技术职业学院，珠海 519090)



响应面法优化酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的研究

曾健辉1， 朱宝君1， 王娟2， 孔繁茂1， 马广智1，3*， 黄儒强1*

(1.华南师范大学生命科学学院，广州 510631；2.华南理工大学食品科学与工程学院，广州 510600；3.广东科学技术职业学院，珠海 519090)

鱼鳞是鱼类加工的下脚料之一，含有丰富的蛋白质和矿质元素等营养物质，是非常好的可利用生物资源. 文中研究了碱性蛋白酶酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的优化工艺. 以ACE抑制率为指标，在酶解温度、酶解pH、加酶量、底物质量浓度等条件下先进行单因素实验，在此基础上运用响应面法优化碱性蛋白酶酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的工艺条件. 结果表明：在加酶量6.1%(约12 000 U/g)、pH 8.9、温度54.7 ℃的条件下酶解2 h，ACE抑制率理论值为85.36%，实际酶解物的ACE抑制率为86.2%，相对误差为0.91%.

响应面法； 酶解； 鱼鳞； ACE抑制肽

高血压是一种心血管疾病，不仅发病率高，对心、脑、肾等重要器官易造成损害，严重危害人类健康[1-2]. 血管紧张素转换酶(Angiotension-Converting Enzyme, ACE EC 3.4.15.1，简称ACE)是一种含锌的二肽羧基肽酶. 人体肾素-血管紧张素系统是体内重要的血压调控系统，ACE在调控系统中具有重要的生理作用，它能够催化血管紧张素I转化成具有强烈血管收缩作用的血管紧张素II，同时能使具有血管扩张作用的缓激肽失活，导致血压上升[3]. 因此，通过抑制ACE活性就可以降低血压或阻止血压上升. 目前治疗高血压的药物大多是化学合成的，服用这些合成药物会伴有不同程度的咳嗽、味觉失真等副作用或其他不良反应[4]. 因此人们除了期待良好的降压效果外，更加注重药物的安全性. 来源于食品的降血压肽由于具有安全性高、降压效果明显、无副作用等优点，已经逐渐成为研究的热点[5]，国内外研究者已从植物蛋白[6-9]、动物蛋白[10-12]等多种蛋白的酶解物中分离提取出了ACE抑制肽.

我国海域辽阔、水资源丰富，随着渔业及鱼类加工业的迅速发展，在鱼类产品生产和加工的过程中也产生了大量的下脚料(如鱼皮、鱼鳞、鱼骨等)，其中鱼鳞占15%左右[13]. 这些鱼鳞基本都是作为废弃物直接丢弃，不仅浪费资源而且污染环境. 鱼鳞中含有丰富的蛋白质(约占鱼鳞的50%～70%)、脂肪(卵磷脂、多种脂肪酸)及多种矿物质、维生素和微量元素[14-15]，是价值非常高的生物资源. 因此，充分利用鱼鳞资源不仅能提高其利用价值和经济价值，创造良好的经济与社会效益，还能减少环境污染，具有十分重要的意义. 本研究以鱼鳞为原料，以ACE抑制率为指标，在单因素实验基础上运用响应面法优化了碱性蛋白酶酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的工艺条件，为鱼鳞的综合利用和深加工提供一定的理论依据.

1　材料与方法

1.1材料试剂

鱼鳞，新鲜的鱼鳞购自于市场；碱性蛋白酶(2.0×105U/g)，购于江苏瑞阳生物有限公司；ACE、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)均购自于美国Sigma公司；其他化学试剂均为分析纯.

1.2仪器与设备

电热恒温水浴锅:HWS12，上海一恒仪器公司；pH计:PB-10型，赛多利斯科学仪器有限公司；冷冻干燥机:VirTis，美国SP公司；台式高速冷冻离心机:CT15RT，天美科学仪器有限公司；恒温磁力搅拌器:85-2，上海思乐仪器厂；分析天平:BSA224S，赛多利斯科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计:UV-5100B，上海元析仪器有限公司.

1.3方法

1.3.1工艺流程鱼鳞→预处理→脱钙→酶解→离心→上清液冷冻干燥→成品分析. 技术要点 (1)鱼鳞预处理：将鱼鳞用水清洗干净，用10%NaCl溶液浸泡鱼鳞24 h，中间换液1次. (2)脱钙：用0.4 mol/L的HCl溶液浸泡鱼鳞脱钙90 min，脱钙后的鱼鳞用于ACE抑制肽的制备. (3)鱼鳞酶解物的制备：取适量鱼鳞于蒸馏水中溶涨1 h，恒温水浴保温15 min，调节pH，加入适量酶进行酶解，酶解结束后立即在沸水中加热10 min灭酶，冷冻离心15 min(4 ℃, 4 000 r/min)，上清液冷冻干燥后备用.

1.3.2 ACE抑制率测定(采用紫外分光法)[22]取酶解物冻干粉适量溶于0.1 mol/L(含0.3 mol/L NaCl pH 8.3)的硼酸盐缓冲液配成ACE抑制肽，将HHL溶于0.1 mol/L(含0.3 mol/L NaCl pH 8.3)的硼酸盐缓冲液中配成浓度为5 mmol/L的底物. 取50 μL HHL加入20 μL ACE抑制肽充分混匀，在37 ℃下水浴5 min 后，加入10 μL ACE， 再于37 ℃ 下水浴30 min. 反应结束后加入150 μL l mol/L HCl 终止反应. 向反应器中加入1 mL 乙酸乙酯(冷)漩涡混合30 s后离心10 min(4 000 r/min)，吸取750 μL乙酸乙酯于试管中，放入100 ℃烘箱中挥发溶剂30 min，再用4 mL去离子水溶解试管底部的马尿酸，漩涡混匀1 min后于228 nm下测定吸光值. ACE抑制率计算公式为[16]:

其中：对照组是ACE抑制肽不参与反应条件下的吸光值；样品组是ACE和ACE抑制肽都存在的条件下的吸光值；空白组是ACE不参与反应条件下的吸光值.

1.3.3单因素实验本实验在前期研究的基础上选用碱性蛋白酶对鱼鳞进行酶解，以酶解物的ACE抑制率为指标考查底物质量浓度(g·L-1)、温度(℃)、加酶量(%)、pH和时间(h)对酶解的影响.1.3.4响应面实验在单因素实验的基础上，在一定底物质量浓度(50 g/L)和一定酶解时间(2 h)下，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，进一步进行三因素三水平的响应面分析试验，选取酶解温度(A)、pH(B)和加酶量(C)为自变量，ACE抑制率为响应值，确定各因素对酶解物的ACE抑制率影响的显著性和各提取条件的最佳组合，其编码水平见表1.

表1　响应面法的因素水平编码

2　 结果与分析

2.1单因素实验

研究了底物质量浓度、pH、温度、加酶量和时间对碱性蛋白酶酶解的影响，实验结果见图1.随着底物质量浓度的增大，酶解物的ACE抑制率呈现先上升后下降的趋势(图1A)，底物质量浓度在10～50 g/L时，ACE抑制率随底物质量浓度增大而增大，50 g/L时达到最高. 随着底物质量浓度继续增大，酶的活性部位被底物所饱和，酶解效果减弱，ACE抑制率降低. 选择底物质量浓度50 g/L进行后续酶解实验.

酶解物的ACE抑制率随着pH呈现先上升后下降的趋势. pH 9时(图1B)，ACE抑制率达到最高. 当pH大于9时，ACE抑制率随pH增大而降低，说明较高的pH导致蛋白酶活性下降甚至失活，不利于酶解. 选择pH 9进行后续酶解实验.

温度对酶解物ACE抑制率影响显著,随着温度的升高酶解物的ACE抑制率呈现先上升后下降的趋势，在45～55 ℃，随着温度的升高酶解物的ACE抑制率增大，在55 ℃时达到最大(图1C)，在55～60 ℃间，ACE抑制率基本保持不变. 而温度在60～65 ℃时，ACE抑制率出现下降的趋势. 温度对酶解的影响主要表现在2方面：一方面温度影响酶的活性，温度过低或者过高都会影响酶的活性，导致ACE抑制率降低；另一方面温度影响反应速率，一般随着温度升高反应速率增大，温度过高会使酶活性减弱甚至失活. 选择55 ℃进行后续酶解实验.

随着加酶量的增大，酶解物的ACE抑制率呈现先上升后下降的趋势(图1D). 加酶量由2%～6%增加时，ACE抑制率呈上升趋势，随着加酶量的增大，酶解反应速率加快，ACE抑制率升高，当加酶量大于6%时，ACE抑制率略有降低，当加酶量继续增大时，反应速率由底物质量浓度控制，继续增大加酶量对酶解反应影响不大，考虑到生产成本，选择最适加酶量6%进行后续酶解实验.

从1 h开始，随着酶解时间的延长酶解物的ACE抑制率呈现上升趋势(图1E). 在酶促反应初始阶段，酶和底物质量浓度都较高，反应速率快，当酶解时间超过2 h后ACE抑制率逐渐下降，随着反应的进行，酶解产物可能被蛋白酶进一步分解，导致ACE抑制率下降，所以选择反应时间2 h进行后续酶解实验.

2.2响应面法优化酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的工艺研究

2.2.1二次响应面回归模型的建立与分析选用中心复合模型，做三因素三水平共17个试验点，其中5个中心点，12个析因点，实验设计和结果见表2. 对响应面结果进行多元回归拟合，得到相应回归方程为[17]：

图1　各因素对酶解的影响

Figure 1Influence of enzymatic hydrolysis by single factor experiment

抑制率=85.22-0.88a-1.90b+0.60c+1.36ab-4.25ac+0.90bc-9.63a2-10.77b2-5.89c2，

其中，a、b、c分别表示在因素A、B、C下的不同反应条件.

用 Design Expert 8.0.5b 软件对表2中的数据进行多元回归分析(表3). 以ACE抑制率为响应值时，回归方程拟合检测P<0.000 1，差异极显著，同时失拟项P=0.783 0>0.05，差异不显著，说明未知因素对试验干扰很小，模型拟合度较好[18]. 同时回归方程相关系数R2=0.988 6，说明响应值的变化有98.86%来源于所选变量[19]. 该分析统计结果说明实验方法是可靠的，能较好地描述各因素与响应值之间的真实关系. 各因素对ACE抑制率的影响程度大小依次为：B(pH)>C(加酶量)>A(温度). 由方差分析(表3)可知，AC之间交互作用显著，二次项A2、B2、C2均极显著(P<0.001)，而交互项BC及AB之间交互作用的影响差异不显著.

表2　响应面实验设计及结果

表3　回归模型及方差分析结果

注：**为差异极显著(P<0.01)

2.2.2各因子交互作用对ACE抑制率影响的分析图2直观地反映了各因素对响应值的影响，3组图比较可知，因素B(pH)对鱼鳞酶解物ACE抑制率的影响最为显著，表现为曲线较为陡峭，因素C(加酶量)次之，而因素A(温度)相对于因素B和C表现为曲线较为平滑，响应值变化较小.

图2　各因子交互作用对酶解物ACE抑制率的响应曲面图

2.2.3验证实验通过Design Expert 8.0.5b软件分析得到的鱼鳞酶解物的ACE抑制率最高的酶解条件为加酶量6.1%、pH 8.9、温度54.7 ℃. 在此条件下，酶解鱼鳞得到酶解物的ACE抑制率理论值为85.36%，实际酶解物的ACE抑制率为86.20%，相对误差为0.91%，而且重复性较好，说明优化结果可靠.

3　 结论

本研究以酶解物的ACE抑制率为指标，在单因素试验的基础上进行响应面实验，确定了碱性蛋白酶水解鱼鳞制备ACE抑制肽的优化条件为加酶量6.1%、pH 8.9、温度54.7 ℃、底物质量浓度为50 g/L，酶解2 h得到酶解物的ACE抑制率为86.20%. 本实验得到的抑制肽对ACE有明显的抑制效果，为鱼鳞的进一步开发和深加工提供一定的理论基础，后续还需要对抑制肽进行进一步的分离纯化以及结构鉴定，以期得到结构明确且降压效果好的ACE抑制肽.

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【中文责编：成文英文责编：李海航】

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Preparation of ACE Inhibitory Peptides from Fish Scale by Response Surface Method

ZENG Jianhui1, ZHU Baojun1, WANG Juan2, KONG Fanmao1, MA Guangzhi1,3*, HUANG Ruqiang1*

(1. School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China;2. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510600, China；3. Guangdong Institute of Science and Technology, Zhuhai 519090, China)

Fish scale is one of the fish processing leftover, with abundant nutrients like protein and mineral elements, which makes it a usable biological resource. This paper study the preparation of ACE inhibitory peptides by alkaline protease hydrolysis of the fish scale. The enzymatic hydrolysis conditions for the preparation of ACE inhibitory peptides were optimized using the response surface method based on single factor experiments, including hydrolysis temperature, hydrolysis pH, enzyme dose and substrate concentration. The results showed that the optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows: enzyme dose 6.1% (about 12 000 U/g), pH 8.9, hydrolysis temperature 54.7 ℃ for 2 hours. Under these conditions the theoretical value of ACE inhibition rate was 85.36%, and the actual ACE inhibition rate was 86.2%, in which the relative error was 0.91%.

response surface method; enzymatic hydrolysis; fish scals; ACE inhibitory peptides

2016-01-01《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

广东省产学研项目(2013B090600153)；广东省科技计划项目(2013B020312004)；广东省海洋渔业科技推广专项科技攻关项目(A201301C10)

马广智,教授，Email：magzh59@126.com；黄儒强,教授级高级工程师,Email：qiangdoctor@126.com.

TS254.9

A

1000-5463(2016)04-0057-05