不同品种枇杷果实酚类物质及其抗氧化活性分析

林素英,谢文燕,何松涛,蔡丽娜,谢晓梅,吴锦程,*

(1.莆田学院环境与生物工程学院,福建莆田 351100;2.福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室,福建莆田 351100)



不同品种枇杷果实酚类物质及其抗氧化活性分析

林素英1,2,谢文燕1,何松涛1,蔡丽娜1,谢晓梅1,吴锦程1,2,*

(1.莆田学院环境与生物工程学院,福建莆田 351100;2.福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室,福建莆田 351100)

以福建主产“早钟6号”、“长红3号”、“解放钟”和“白梨”与引进的“宁海白”枇杷为试材,研究其酚类物质组成与抗氧化能力,并进行相关性分析。结果表明,枇杷果实果肉总酚含量范围为327.31～615.22 μg/g,高低顺序为“解放钟”>“早钟6号”>“宁海白”>“白梨”>“长红3号”;酚类物质对DPPH自由基均有良好的清除效果,表明对铁离子均有较强的还原能力,可以作为天然抗氧化材料进行开发应用,总抗氧化能力“宁海白”>“早钟6号”>“解放钟”>“长红3号”>“白梨”。HPLC检测5个品种枇杷均含有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、鞣花酸、阿魏酸等7种酚单体,但含量差异较大,其中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸含量较高,且与抗氧化能力显著正相关,绿原酸在5个品种中的含量差异达到显著水平(p<0.05)。

枇杷,品种,抗氧化能力,酚类物质,绿原酸

酚类物质是植物重要的次生代谢产物之一,广泛存在于植物中,影响植物的品质[1],由于酚类物质结构中携有一个或多个羟基,对自由基有良好的清除能力,表现出很强的抗氧化活性,因而植物酚类物质及抗氧化活性研究成为近年农业科研领域的热点[2-3],在枇杷叶[4]、花[5-6]、核[7]、果[8-9]已有相关报道。研究表酚类具体的组成及各成分含量与抗氧化能力有很高的相关性[10],在枇杷花[11]、叶[12]中也得到相同结果,枇杷果实中酚类的组成研究较少,仅张文娜[13]、徐红霞[10]等研究了浙江10个品种的枇杷果实酚类物质组成,其他品种尚未见报道。福建是枇杷的主产区之一,2013年年产量达23.7万吨[14],主栽的品种有红肉系的“早钟6号”、“长红3号”、“解放钟”和白肉系的“白梨”等[15-16],本实验以这4种枇杷果实为试材,采用超声波辅助乙醇提取法提取其中的酚类物质,用DPPH法(DPPH自由基清除法)和FRAP法(铁还原比色法)来评价其抗氧化能力,并使用高效液相色谱法分析酚类组成,研究不同品种果实酚类组成与抗氧化性关系,并与已研究较多的“宁海白”比较,以期为枇杷深加工提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

5种枇杷果实莆田市果树研究所提供,按成熟时间分为早熟的“早钟6号”,中熟的“长红3号”和“宁海白”,中晚熟的“白梨”及晚熟的“解放钟”,果实于正常食用成熟度采收,当天运至实验室,选取成熟度一致、无虫害、无明显损伤、果实饱满的枇杷置于-70 ℃超低温冰箱冷冻保存待用;表儿茶酸、鞣花酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸美国Sigma公司;新绿原酸、隐绿原酸、TPTZ(2,4,6-反式2-吡啶基三嗪)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈色谱纯，国药集团化学试剂有限公司;其他试剂分析纯;实验用水超纯水。

Agilent 1100高效液相色谱仪美国Agilent公司采用紫外检测器ZORBAXSB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);722-型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司;KQ-100DE型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;KDC-40低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司;Ultra pure超纯水机上海和泰仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1枇杷果实酚类物质提取果实从冰箱取出去皮去核后,果肉迅速切成碎末,准确称取10.000 g,加入30 mL 70%乙醇溶液,浸泡1 h,超声提取20 min(温度30 ℃,功率200 W),再以5000×g的转速离心20 min,减压抽滤得到滤液,滤液用70%乙醇定容至50 mL,即为枇杷果实提取液,用于测定DPPH·的清除能力和铁离子还原能力及浓缩后用于酚类物质分析。

1.2.2总酚含量测定采用Folin-Ciocaileu比色法测多酚含量[17],取1 mL提取液加入20 mL水,2.5 mL FoLin-CiocaLteu试剂,反应5 min后加入2.5 mL饱和碳酸钠溶液,最后加水定容至50 mL静置2 h,于765 nm波长处测定其吸光度。以没食子酸(GAE)为标样绘制标准曲线,根据标准曲线计算样品中总酚含量,结果以样品中含有的没食子酸当量(μg/g FW)表示。

1.2.3提取液枇杷果实抗氧化能力的测试

1.2.3.1清除DPPH·能力的测定参照文献[18]加以修改,DPPH乙醇溶液浓度为2.13×10-4mol/L,取等体积的DPPH溶液和枇杷提取液混合,室温避光反应30 min后于517 nm波长处测定其吸光度(Ai);等体积的DPPH溶液和乙醇混合,测溶液的吸光值(A0);等体积的提取液和乙醇混合,测溶液的吸光值(Aj)。记录A0,Ai和Aj,按下列公式计算清除率IP:

IP(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。

1.2.3.2铁离子还原力测定参照文献[19]方法测试提取液FRAP值。取1 mL提取液,稀释至25 mL。取该稀释液1 mL,加入2.7 mL FRAP工作液(20 mmol/L三氯化铁溶液、300 mmol/L醋酸盐缓冲液、10 mmol/L TPTZ溶液按1∶10∶1配制),加入6 mL水,37 ℃下反应10 min后测定593 nm处的吸光度。以硫酸亚铁铵溶液为标样绘制标准曲线,以达到相同吸光度所需硫酸亚铁的量来计算样品FRAP值,单位为mmol/L。

1.2.4枇杷果实提取液的HPLC分析

1.2.4.1HPLC检测条件色谱柱:Kromasil C18(150 mm×4.6 mm);进样量:20 μL;流速:0.8 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:280 nm;流动相A:5%乙酸水溶液;流动相B:100%乙腈。梯度洗脱程序[20]:0～25 min时A从90%降至70%,25～35 min时A从70%升回至90%。

1.2.4.2酚单体的HPLC分析分别准确称取7种酚单体对照品,用色谱纯的甲醇溶解,配制成0.1 mg/mL的溶液,测定其保留时间。再配制各酚单体浓度为0.1 mg/mL的混合对照品溶液并逐级稀释,测定峰面积,计算得到浓度与峰面积的回归方程,溶液测试前过0.45 μm的滤膜。

1.2.4.3样品的处理与分析取25 mL的提取液减压蒸馏除去乙醇,再用正己烷萃取3次,通过减压蒸馏除去正己烷后,用甲醇定容到5 mL,用于HPLC分析,溶液测试前过0.45 μm的滤膜,采用外标法计算含量。

1.3综合抗氧化能力指数(APC)的计算

参照文献[21]计算综合抗氧化能力指数(APC)来进行提取液中酚类物质抗氧化活性的总体比较:

APC指数=∑[每种方法测定值/(每种方法测定最大值×测试方法总数)]

1.4数据分析

所有测定重复3次,运用Origin 8.5软件进行数据作图,运用SPSS 20软件进行数据分析:单因素显著性分析(One-way analysis of variance,ANOVA),皮尔森相关性分析(Pearson’s correlation analysis)。所得结果采用平均数据±标准偏差表示。

2　结果与分析

2.1不同品种枇杷果实总酚含量与抗氧化活性分析

表1　不同品种枇杷果实酚类物质含量比较(μg/g FW)

注:同行不同字母表示差异显著,p<0.05；表2同。

表2　不同品种枇杷果实提取物抗氧化能力比较

没食子酸线性回归方程为y=0.0078x+0.0026,R2=0.9986,线性范围:4.10～28.67 mg/L。对照回归方程可得5个品种枇杷果实的总酚含量介于327.31～615.22 μg/g之间(见表1),高低顺序为“解放钟”>“早钟6号”>“宁海白”>“白梨”>“长红3号”,其中“宁海白”的总酚含量与冯健君[22]的报道吻合,比徐红霞[9]的结果低,可能是由生长环境及成熟度不同引起。“早钟6号”与“解放钟”果实的总酚含量接近于“长红3号”与“白梨”含量的2倍,组间差异达到显著水平。

由表2可知道,5个品种枇杷果实提取液均有抗氧化活性,其中DPPH法显示清除能力排序为 “宁海白”>“早钟6号”>“长红3号”>“解放钟”>“白梨”,“早钟6号”与“解放钟”、“白梨”的差异达到显著水平;FRAP法(回归方程为y=0.9686x-0.0333,R2=0.9982,线性范围:0.2～2.0 mmol/L测定的结果显示各品种抗氧化能力排序为“宁海白”>“早钟6号”>“解放钟”>“长红3号”>“白梨”。DPPH法主要评价物质的清除自由基能力,FRAP法评价物质的还原能力[13],测试方法不同,响应物不同,2种评价结果不完全一致说明反应底物可能有区别,可进一步分析其组成。

综合抗氧化能力指数APC显示福建产的红肉系的“早钟6号”、“解放钟”、“长红3号”总抗氧化活性高于白肉系的“白梨”,“早钟6号”正是福建主栽的枇杷品种,抗氧化能力较高说明其在营养保健方面有一定优势。

2.2不同品种枇杷果实酚类物质组成分析

2.2.1不同品种枇杷果实的酚类物质组成定性定量分析参考文献报道[23-24],通过对比对照品、样品及加标样品的保留时间,用HPLC法共鉴定出7种酚类物质,按出峰时间排序为:新绿原酸,绿原酸,隐绿原酸,表儿茶素,咖啡酸,鞣花酸,阿魏酸(图1)。各酚含量总体上为绿原酸>新绿原酸>隐绿原酸>表儿茶素>阿魏酸>咖啡酸>鞣花酸(表1),绿原酸含量明显高于其他酚类物质,与报道相符[25],且其在5个品种中的含量差异达到显著水平,其中“宁海白”中最高,“早钟6号”次之;新绿原酸和隐绿原酸的含量大小顺序均为“宁海白”>“早钟6号”>“长红3号”>“解放钟”>“白梨”;表儿茶素、咖啡酸、鞣花酸和阿魏酸的含量较低,大小顺序随品种变化较大。整体上看“宁海白”和“早钟6号”的各种酚单体含量均比较高,“白梨”最低;“长红3号”与“解放钟”中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、表儿茶素等的含量差异均达到显著水平,但总含量相近,这与其总抗氧化能力大小相符。

图1　5种枇杷果实酚类组成HPLC图Fig.1　HPLC chromatogram of phenolic compounds in loquat fruit of five cultivars注：1-新绿原酸，2-绿原酸，3-隐绿原酸，4-表儿茶素，5-咖啡酸，6-鞣花酸，7-阿魏酸。

表3　枇杷果实抗氧化物质成分与抗氧化能力相关性分析

注:*,在0.05水平(双侧)上显著相关;**,在0.01水平(双侧)上显著相关。

2.2.2枇杷果实抗氧化物质组成与抗氧化能力相关性分析从表3可见,总酚含量及HPLC法测定的总含量与DPPH清除能力、FRAP值都呈正相关关系,其中与总酚含量DPPH的相关性到达显著水平,但酚单体与抗氧化能力DPPH、FRAP的关系不尽相同。其中新绿原酸、绿原酸含量与DPPH呈显著的正相关(r分别为0.941、0.887,p均小于0.05),与FRAP存在正相关。隐绿原酸含量与DPPH存在极显著的线性正相关关系(r=0.963,p小于0.01),与FRAP存在正相关但相关性不显著。表儿茶素含量与DPPH、FRAP;咖啡酸含量与DPPH、FRAP;鞣花酸含量与DPPH均呈中等强度相关但影响效果不显著。其它酚单体与抗氧化能力的相关性较弱,可能是因为含量较低或者本身抗氧化能力比较弱。

3　结论

运用2种方法来评价枇杷果实抗氧化能力,结果表明“宁海白”的抗氧化能力最高,“白梨”的抗氧化能力最低。福建产的枇杷抗氧化能力为:红肉枇杷果实>白肉枇杷果实,“早钟6号”最高。HPLC检测表明在5种枇杷果实中均存在7种酚类物质,分别是新绿原酸,绿原酸,隐绿原酸,表儿茶素,咖啡酸,鞣花酸,阿魏酸。绿原酸含量最高,其次是新绿原酸、隐绿原酸,这三种酚含量与抗氧化能力显著正相关,是主要的抗氧化性活性酚类物质。

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Phenolic contents and antioxidant activity in the fruit of different loquat cultivars

LIN Su-ying1,2,XIE Wen-yan1,HE Song-tao1,CAI Li-na1,XIE Xiao-mei1,WU Jin-cheng1,2,*

(1.Environment & Biological Engineering of Putian University,Putian 351100,China;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Ecology-toxicological Effects & Control for Emerging Contaminants,Putian 351100,China)

Five loquat cultivars were used as the experimental materials,including “Zaozhong No.6”,“Changhong”,“Jiefangzhong” and “Baili” in Fujian province and the introduced “Ninghaibai” loquat. The composition and contents of phenolic compounds in the fruit pulp were determined. Meanwhile,the antioxidant activities of phenolic extracts were evaluated,and the correlative analysis between antioxidant capacity and antioxidant composition was assessed. The results showed the total phenolic content was 327.31～615.22 μg/g,and the sequence of their contents was “Jiefangzhong”>“Zaozhong No.6”>“Ninghaibai”>“Baili”>“Changhong”. Phenols from 5 cultivars showed strong radical scavenging activity against DPPH and ferric reducing power,the antioxidant potency composite followed the order:“Ninghaibai”>“Zaozhong No.6”>“Jiefangzhong”>“Changhong”>“Baili”. Seven phenolic compounds,including 3-Caffeoylquinic acid,4-Caffeoylquinic acid,5-Caffeoylquinic acid,epicatechin,Caffeic acid,ellagic acid and ferulic acid were identified from loquat fruits. The content of phenolic in different cultivars varied significantly. Among those compounds,3-caffeoylquinic acid showed the highest content followed by 5-caffeoylquinic acid and 4-caffeoylquinic acid,which showed a marked positive correlation with antioxidant capacity. The content of 3-chlorogenic acid in the five varieties reached a significant level.

loquat;cultivars;antioxidant capacity;phenolic contents;3-Caffeoylquinic acid

2016-03-11

林素英(1979-),女,硕士,讲师,研究方向:天然产物化学与化学生物学,E-mail:linsuying@ptu.edu.cn。

吴锦程(1965-),男,大学本科,教授,研究方向:果实采后生理生化,E-mail:wjc2384@163.com。

福建省教育厅资助项目(JA13282);莆田学院大学生创新项目(201511498030);福建省科技计划重点项目(2011N0028)。

TS255.4

A

1002-0306(2016)18-0149-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.020