浒苔多糖的酶法降解及其工艺条件优化的研究

张高丽,李银平,赵　梅,刘盟梦,王　鹏

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)



浒苔多糖的酶法降解及其工艺条件优化的研究

张高丽,李银平,赵梅,刘盟梦,王鹏*

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

采用生物酶法将浒苔多糖降解为分子质量较小、粘度较低的浒苔寡糖,以还原糖生成量作为指标,通过单因素和响应面法优化降解工艺,利用液相色谱和质谱技术对酶解产物进行了组分分析。结果表明:浒苔多糖降解酶能够实现对浒苔多糖的高效降解,最适酶解条件为加酶量1.5%、底物质量浓度14 mg/mL、初始pH=6.5、反应时间6 h、温度33 ℃,在此条件下,还原糖生成量为165.21 mg,降解率为61.21%,粘度由349.89 mPa·s降低至2.05 mPa·s。单糖组成结果表明酶解产物由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖组成,质谱分析表明酶解产物包括酸性寡糖片段和中性寡糖片段。

浒苔多糖,降解酶,响应面,粘度,酶解工艺

浒苔属(Enteromorpha)又名苔条、青海苔,属于绿藻门绿藻纲石莼目石莼科。野生浒苔广泛分布于世界各地沿海,且含有丰富的营养物质。其中可溶性多糖和粗纤维占主要部分,约为干重的63.9%,粗蛋白13.21%,脂肪1.04%,灰分21.87%[1],具有巨大的开发潜力。浒苔可溶性多糖作为浒苔的主要活性成分之一,糖链由鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖、葡萄糖构成且摩尔比为15.2∶5.3∶4.7∶1.5∶1.0,且含有大量的硫酸基,重均分子量620.3 ku[1]。因其抗癌、抗病毒、调节血脂、降血糖的功能、且毒性小安全性高等特点倍受关注[2]。虽然浒苔多糖具有良好的生物活性,但因其自身较大的分子量和较高的粘度影响了其吸收性及生理功能,限制其进一步应用。研究发现通过物理、化学方法将多糖降解为分子质量较低的寡糖,降低固有粘度,可大大提高其使用价值和应用范围[3]。

目前常用的浒苔多糖降解方法包括酸解法、微波辅助酸解法等,但通过酸解法得到的寡糖分子量分布较宽且糖链基团及结构受到一定程度影响;通过微波辅助酸解法得到的寡糖收率较低,且生产成本高[4]。相较于物理、化学方法,生物酶法因具有特异性强、酶解条件温和、工艺简单及水解可控等特点,成为多糖降解的最理想手段。浒苔多糖作为一种聚阴离子异质多糖,其糖链结构特殊,现有的工具酶不能有效将其水解。

本实验室前期通过筛选、培养获得一种浒苔多糖降解酶,能够有效降解浒苔水溶性多糖。实验以还原糖生成量为指标,进行单因素实验,在此基础上进行响应面实验优化,探求浒苔多糖降解最佳工艺条件,然后利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)和电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)技术对降解产物的结构和聚合度进行研究,以期为浒苔寡糖的开发和利用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

浒苔粉由青岛海大生物集团有限公司提供;浒苔多糖降解酶(1200 U/mL)分子质量约70 ku,由实验室保存的菌株Alteromonas. A321发酵获得[4];果胶酶(30000 U/g)、纤维素酶(200000 U/g)Sigma公司;α-淀粉酶(4000 U/g)、β-淀粉酶(5000 U/g)大连美仑生物技术有限公司;DNS试剂[5];苯酚、硫酸、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇均为分析纯。

LDZX-40BI型自动电压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;DL6MB型大容量离心机西安禾普生物科技有限公司;722型分光光度计上海浦东物理光学仪器厂;HHS21-4电热恒温水浴锅北京长安科学仪器厂;FD-1A-50真空冷冻干燥机西安太康生物科技有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用途真空泵郑州长城仪器厂;PHS-3C精度上海雷兹仪器厂;Agilent 1200 Series高效液相色谱仪Agilent公司;布鲁克amaZon SL离子阱电喷雾质谱德国布鲁克道尔顿公司;MCR101流变仪奥地利安东帕有限公司。

1.2实验方法

1.2.1浒苔多糖制备称取120 g浒苔粉加入到3.5 L水中,高压灭菌锅121 ℃提取30 min,4000 r/min离心10 min,获得一定质量浓度的浒苔多糖溶液[6-7]。

1.2.2单因素优化实验50 mL浒苔多糖溶液反应体系,在浒苔多糖降解酶初始加酶量1.5%、底物质量浓度10 mg/mL、初始pH=6.5、反应时间4 h、反应温度35 ℃下分别研究不同的加酶量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、底物质量浓度(8、10、12、14、16 mg/mL)、pH(4、5、6、7、8、9、10)、温度(25、30、35、40、45、50 ℃)和反应时间(0.5、1、2、3、4、5、6 h)对浒苔多糖降解效率的影响。

1.2.3响应面法实验在单因素实验基础上,确定初始pH=6.5,加酶量为1.5%,以底物质量浓度、反应温度、反应时间为自变量,还原糖生成量为响应值(Y),利用软件Design-Expert 8.0.6进行Box-Benhnkn实验设计,因素编码如表1所示。

表1　Box-Benhnkn实验因素水平及编码

1.2.4还原糖生成量测定采用DNS比色法[8],还原糖生成量=m2-m1,其中m1为初始还原糖总量,m2为降解后还原糖总量。

1.2.5多糖降解率测定采用苯酚-硫酸法[8],

式(1)

式中:ρ1为加入等量灭酶活的浒苔多糖经醇沉复溶后总糖质量浓度(mg/mL);ρ2为加入等量不同酶制剂的浒苔多糖经醇沉复溶后总糖质量浓度(mg/mL);v为样品体积(mL)。

1.2.6浒苔多糖酶解产物的制备取适量浒苔多糖,按1.2.3优化的条件进行酶解,酶解结束立即煮沸5 min灭酶活,冷却,加入2倍无水乙醇,4 ℃静置过夜,4000 r/min离心10 min,透析脱盐后浓缩,得上清寡糖样品,冻干备用。

1.2.7 酶解产物的HPLC分析参考韩莎莎等[3]报道方法略有改动。将浒苔多糖的酶解产物通过酸解(三氟乙酸)、柱前衍生(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP),然后进行色谱分析。色谱条件:色谱仪:Agilent1200 Series 高效液相色谱仪;色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(15 cm×4.6 mm,5 μm);流速1.0 mL/min;进样量10 μL;检测器为紫外检测器(VWD),波长254 nm,柱温及检测器温度设定为25 ℃。

1.2.8酶解产物的ESI-MS分析参考韩莎莎等[3]报道方法略有改动。将酶解产物通过乙腈溶解后,取2 μL样品进行负离子模式质谱分析。毛细管电压:-140 V;质量扫描范围:m/z 100～2000。

表2　酶制剂反应条件

1.2.9不同酶制剂对浒苔多糖降解效果的比较分别将α-淀粉酶、β-淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、浒苔多糖降解酶调节至酶活为200 U/mL,按优化的条件固定加酶量1.5%、底物质量浓度14 mg/mL、酶解时间6 h,根据商品酶的产品说明确定其最适pH和温度,具体见表2。反应结束后立即煮沸5 min将酶灭活,测定其粘度和还原糖生成量。加2倍体积无水乙醇,4 ℃静置过夜,4000 r/min离心10 min,沉淀复溶至初始体积,测定总糖质量浓度,以加等量灭活酶制剂的处理作为对照组,计算多糖降解率。

1.2.10粘度测定采用MCR101流变仪,取适量样品选用pp50转子以300 r/s转速室温测定2 min,计算平均粘度[9]。

1.3数据处理

所有数据均为3次重复实验的平均值,运用Excel数据处理软件和利用Design-Expert 8.0.6软件中的多元线性回归分析程序对实验结果进行处理。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1加酶量对浒苔多糖降解效率的影响由图1可知,加酶量在0.5%～1.5%范围内,还原糖生成量迅速增加,之后随着加酶量增加,还原糖生成量增加趋于平缓。因为在一定的底物浓度下,酶尚未被饱和,所以前期随着加酶量的增加,酶解效率升高,还原糖生成量明显增加;但随着加酶量逐渐加大,酶分子间的竞争性抑制作用增强,导致只有一部分酶与底物结合从而使得还原糖生成量只有少量增加[10]。考虑到实际生产,选择1.5%为最适加酶量。

图1　加酶量对浒苔多糖降解效率的影响Fig.1　Effect of enzyme dosage on hydrolysis efficiency of PE

图2　底物质量浓度对浒苔多糖降解效率的影响Fig.2　Effect of substrate concentration on hydrolysis efficiency of PE

2.1.2底物质量浓度对浒苔多糖降解效率的影响由图2可知,随底物质量浓度增大,还原糖生成量呈先增大后降低趋势,12 mg/mL时还原糖生成量最高。在较低底物质量浓度下,随着底物质量浓度不断增大,酶活中心分子饱和,还原糖生成量达到最大值;当底物质量浓度过大,底物粘度过高导致酶与底物接触概率下降,故降解效率表现为下降趋势[11],因此确定12 mg/mL为最适底物质量浓度。

2.1.3pH对浒苔多糖降解效率的影响由图3可知,当pH=7时还原糖生成量最大,pH过高或过低都会抑制浒苔多糖降解酶的活性。这是因为酶活力和构像与溶液体系的pH有关,pH能够影响酶活性中心的必需基团的解离程度,进而影响浒苔多糖降解酶分子对底物的结合和催化过程[12],由于浒苔多糖溶液初始pH6.5接近于7,为简化操作确定初始pH6.5为最适底物pH。

图3　pH对浒苔多糖降解效率的影响Fig.3　Effect of pH on hydrolysis efficiency of PE

2.1.4温度对浒苔多糖降解效率的影响由图4可知,当温度从25 ℃升至35 ℃时,还原糖生成逐渐增加,当温度高于35 ℃时,还原糖生成量下降。在较低温度下温度升高能够促进多糖的溶解和运动,增加酶与底物的接触机率[13],然而温度过高会导致酶分子吸收过多能量,引起维持酶分子结构的次级键断裂,造成蛋白质空间结构发生变化,从而减弱酶活力,降低降解效率[14]。因此确定35 ℃为最适底物温度。

图4　温度对浒苔多糖降解效率的影响Fig.4　Effect of temperature on hydrolysis efficiency of PE

2.1.5酶解时间对浒苔多糖降解效率的影响由图5可知,反应时间在0.5～4 h内,还原糖生成量迅速增加,降解效率较高,当超过4 h时,还原糖生成量趋于平缓。一方面可能是由于酶活力受到了产物的抑制,另一方面随着酶解时间的延长,酶的稳定性逐渐降低,考虑到实际生产成本,因此确定4 h为最适酶解时间[15]。

图5　酶解时间对浒苔多糖降解效率的影响Fig.5　Effect of time on hydrolysis efficiency of PE

2.2响应面实验结果分析

2.2.1响应面设计及结果在单因素实验基础上,利用响应面法对浒苔多糖的酶法降解进行进一步工艺优化。根据响应面Box-Behnken设计17组实验,其中5组中心实验进行实验误差估测,其余12组用于分析因点。固定加酶量1.5%,初始pH=6.5,具体设计组合、实验值及软件预测值如表3所示。

表4　酶解条件回归模型方差分析表

注:*代表显著(p<0.05);**代表极显著(p<0.0001)。

表3　酶解条件优化响应面实验设计及结果

采用Design-Expert 8.0.6软件对表3数据进行二次多项式回归分析,获得还原糖生成量(Y)对底物质量浓度(A)、温度(B)、反应时间(C)的二次多项回归方程:Y=139.77+7.78A-17.17B+14.96C-4.24AB+9.37AC-1.82BC+0.52A2-39.32B2-15.62C2。

对表2中数据进行多元回归分析,结果如表3所示。

2.2.2各因素之间的交互作用采用Design-Expert 8.0.6软件对底物质量浓度、温度、反应时间3个因素间交互作用进行响应面分析,得到以还原糖生成量为响应值的响应面。由等高线形状可观察交互作用大小,椭圆形表示交互作用较强,反之形状越圆表示交互作用越弱[18]。由此分析所有等高线图和响应曲面,其中底物浓度和时间的交互作用显著见图6。由图6可知,当固定温度为35 ℃时,反应时间升高到最优值时,底物浓度对还原糖生成量的影响较小;当底物浓度升高到最优值时,还原糖生成量随时间显著提高。说明时间对响应值峰值的影响大于底物浓度,与回归分析结果相同。

图6　底物浓度和时间交互作用对酶解效率的影响Fig.6　Response surface plots showing interaction effects of hydrolysis conditions between on substrate concentration and time

2.2.3回归模型验证由Design-Expert 8.0.6软件分析可知,酶法降解浒苔多糖最佳工艺条件为底物质量浓度13.96 mg/mL,温度为32.13 ℃,反应时间为5.89 h。在此条件下,得到还原糖生成量的理论值为160.08 mg。为检验响应面优化所得结果的可靠性,在添加量为1.5%,初始pH=6.5下,采用上述优化的实验条件进行验证。从实际操作角度考虑,将此工艺条件调整到底物质量浓度14 mg/mL,温度为33 ℃,反应时间为6 h。在此条件下实际还原糖生成量为165.21 mg,与预测值十分接近且相对误差约3.20%,说明基于响应曲面法所得的酶解优化工艺稳定可靠。

2.3HPLC分析

由图7可知,浒苔多糖酶解产物的2倍醇沉上清的单糖组成为鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖,通过峰面积计算其摩尔比为1.51∶2.30∶6.66∶1。

图7　浒苔多糖酶解产物的HPLC图Fig.7　High performance liquidchromatograms of hydrolysate fractions注:a标准单糖HPLC(1～10分别代表甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、乳糖内标、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖);b为浒苔多糖酶解产物的HPLC图(鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖)。

2.4ESI-MS分析

由图8可知,酶解产物的丰度较高的寡糖片段有五种,从左至右它们的m/z分别为243、341、401、503、665。根据浒苔多糖的单糖分析推测质荷比为243的寡糖为具有取代基的单糖,根据文献报道浒苔多糖上的取代基只能是分子量为80的硫酸基[19],则该单糖的分子量为164,在本实验中是鼠李糖,所以单糖为鼠李糖硫酸酯;质荷比为401的糖推测为二糖脱一分子水,葡萄糖醛酸成酯脱一分子水再失去一个质子[244+194-H2O-H2O-H]-,二者均属酸性寡糖片段。m/z分别为341、503、665,其差值均为162,且自左到右分别为:二糖脱一分子水再失去一个质子[180×2-H2O-H]-,三糖脱两分子水再失去一个质子[180×3-2H2O-H]-,四糖脱三分子水再失去一个质子[180×4-3H2O-H]-。根据单糖组成分析该类寡糖为中性寡糖片段,其分别为葡二糖、葡三糖和葡四糖。

图8　浒苔多糖酶解产物的ESI-MS图Fig.8　ESI-MS spectra of hydrolysate fractions

2.5不同酶制剂对浒苔多糖降解结果比较

由表5可知,浒苔多糖降解酶产生的还原糖最高,纤维素酶次之,α-淀粉酶、β-淀粉酶和果胶酶较低;多糖降解率的趋势与还原糖生成量趋势大致相同;就粘度而言,浒苔多糖降解酶的降粘效果最显著。因此,以浒苔多糖降解酶做为酶制剂,结合本实验的最优酶解工艺,可以实现对浒苔多糖的高效降解,酶解产物低分子糖链可用于活性研究,也可为结构解析提供思路。

表5　不同酶制剂对浒苔多糖降解效率的比较

3　结论

本实验所开展的酶法降解浒苔多糖研究,通过系列单因素和响应面实验优化。多糖降解趋势与还原糖生成量趋势大致相同,因此以还原糖生成量为指标,确定最佳降解工艺为:加酶量1.5%,初始pH=6.5,底物质量浓度14 mg/mL,温度为33 ℃,反应时间为6 h。在此条件下还原糖生成量可达165.21 mg,降解率61.21%,粘度由349.89 mPa·s降低至2.05 mPa·s,降解产物包括酸性寡糖片段和中性寡糖片段。通过与α-淀粉酶、β-淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等酶制剂进行对比,该酶具有高效降解浒苔多糖及显著降粘的作用,可为今后浒苔活性物质提取及不同聚合度寡糖制备提供理论依据及方法指导。

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Study on enzymatic degradation for polysaccharide fromEnteromorphaand its technical condition optimization

ZHANG Gao-li,LI Yin-ping,ZHAO Mei,LIU Meng-meng,WANG Peng*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The purpose of this study was to hydrolyze PE for oligosaccharide using specific PE degradase. The enzymatic hydrolysis conditions were optimized. The saccharide composition of the hydrolysate fractions was analyzed by liquid chromatography and electrospray ionization mass spectrometry. The yield of reducing sugar was chosen as an evaluating indicator during single factor experiments and response surface methodology. Results showed that the enzyme could hydrolyze PE efficiently. The optimal hydrolysis condition was as follows:enzyme dosage 1.5%,substrate concentration 14 mg/mL,the initial pH6.5,reaction time 6 h,and hydrolysis temperature of 33 ℃. The corresponding reducing sugar yield and hydrolysis efficiency was 165.21 mg and 61.21%,respectively. Besides,the viscosity of PE reduced from 349.89 mPa·s to 2.05 mPa·s. The HPLC results indicated that the monosaccharide composition of the hydrolysate was rhamnose,glucuronic acid,glucose and xylose. The results of mass analysis showed that degradase could degrade sulfate PE and neutral PE.

polysaccharides ofEnteromorpha;degrading enzyme;response surface methodology;viscosity;optimization of enzymatic hydrolysis

2016-02-22

张高丽(1990-)，女，硕士，研究方向：食品加工与功能食品，E-mail：sucigel@163.com。

王鹏(1980-)，男，副教授，研究方向：海洋应用微生物，E-mail：pengwang@ouc.edu.cn。

山东省自然科学基金(ZR2015DQ005)；青岛市应用基础研究计划(15-9-1-62-jch)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)18-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.030