酸菜中降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选、鉴定及其在发酵香肠中的应用

崔　珏,孙会刚,朱兆丽,娄雪莲

(1.徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州 221111;2.江苏省食品资源开发与质量安全重点实验室,江苏徐州 221111)



酸菜中降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选、鉴定及其在发酵香肠中的应用

崔珏1,2,孙会刚1,2,朱兆丽1,娄雪莲1

(1.徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州 221111;2.江苏省食品资源开发与质量安全重点实验室,江苏徐州 221111)

目的:依据多项评价指标筛选亚硝酸盐降解能力强且适用于肉制品发酵的乳酸菌。方法:首先采用添加0.3% CaCO3的MRS培养基从15份不同产地的农家自制酸菜中筛选乳酸菌,其后以降解亚硝酸盐能力和肉制品发酵剂所需要求为筛选指标对初筛所得乳酸菌进行复筛,并对其进行菌种的分子鉴定。最后以筛选到的菌株为发酵剂制作单菌株发酵香肠,通过检测香肠在发酵和贮藏期间的NaNO2含量来进一步验证所得菌株的实际降解亚硝酸盐能力。结果:筛选到1株降解亚硝酸盐能力优良(降解率为78.77%)且适于肉制品发酵的乳酸菌菌株,16S rDNA全序列分析鉴定为鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGG,ATCC 53103)。香肠发酵实验结果显示,在发酵结束时香肠的NaNO2含量为12.2 mg/kg,低于国家标准。同时,微生物指标检测结果证明了此条件下生产的发酵香肠的质量是安全可靠的。结论:鼠李糖乳杆菌能有效降低发酵香肠中的NaNO2含量,可用于开发成用于生产低亚硝酸盐的健康、安全的肉品发酵剂。

酸菜,乳酸菌,亚硝酸盐,发酵香肠

食品中过量添加亚硝酸盐的致癌风险已被多项研究证明,然而由于其在加工肉类制品中具有发色、抑菌、抗氧化、增加风味等作用,目前还很难找到完美的替代物质,因此在肉制品生产中还在广泛使用[1-2]。食品中亚硝酸盐的危害主要是由于其可分解生成亚硝基,而亚硝基可与蛋白质代谢产物仲胺类化合物结合生成亚硝胺,而亚硝胺是一种极强的致癌物质,长期摄入可诱发多种消化道癌症[3-4]。2015年,加工类肉制品已被世卫组织列为一级致癌物,主要就是因为亚硝酸盐的添加。因此,寻找能有效降低肉制品中亚硝酸盐的方法是近年来研究的热点。目前降低肉制品中的亚硝酸盐的方法主要有化学法和生物法两类,化学法是通过添加由发色剂、抗氧化剂、多价鳌合剂和抑菌剂混合组成的添加剂来替代亚硝酸盐在肉制品的添加。生物法则是利用微生物产生亚硝酸盐还原酶来降解亚硝酸盐或通过微生物产酸降低环境pH来促进亚硝酸盐分解为NO,从而达到降低肉制品中亚硝酸盐含量的目的[5-6]。

乳酸菌是一类能够进行糖发酵,产生代谢产物乳酸的革兰式阳性细菌,其作为发酵剂已经在发酵香肠的生产过程中广泛使用几百年。乳酸菌在肉制品的加工过程中,由于其可将糖类物质分解形成乳酸而降低肉制品中的pH,从而有效降解肉制品中的亚硝酸盐,同时还可抑制腐败菌和致病菌的生长[7-8]。目前多项研究已从自然发酵食品中筛选到多种具有降解亚硝酸能力的微生物,大多数为乳酸菌,主要包括植物乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、泡菜乳酸菌等,并将其作为发酵剂用于生产各式发酵香肠[9-10]。为了筛选到具有更高降解活性的乳酸菌,本研究以亚硝酸盐降解能力为主要筛选指标从不同产地的农家自制的酸菜中筛选降解亚硝酸盐能力强同时适用于肉制品发酵的乳酸菌,并以其为发酵剂进行单菌株发酵香肠的制作,通过测定香肠发酵期和贮藏期的亚硝酸盐含量,对其降解亚硝酸盐的能力进行验证,以期为开发、生产健康、安全的加工肉制品提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

酸菜分别产自贵州、重庆、四川、云南、湖南、吉林的农家自制酸菜;菌株筛选、培养、生化鉴定所采用的培养基均按文献方法配制[11];猪后腿肉、肥膘、肠衣市售;胡椒粉、食盐、蔗糖、葡萄糖、亚硝酸钠均为食品级。

SHP-150型电热恒温培养箱上海精宏设备有限公司;全自动立式压力蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司医疗设备厂;超净工作台上海博迅实业有限公司医疗设备厂;721G分光光度计上海精密科学仪器有限公司;PHS-3C酸度计上海雷磁。

1.2实验方法

1.2.1乳酸菌筛选分别称取15份酸菜样品各20 g,在无菌条件下加入180 mL无菌蛋白胨水制备成10倍稀释液,4 ℃保存备用。将上述稀释液稀释105后,取0.1 mL涂布于添加0.3% CaCO3的固体MRS培养基中,30 ℃厌氧培养48 h后,挑取具有较大溶钙圈的单菌落。反复划线进行分离纯化,直至显微观察下菌体一致。挑取纯菌进行革兰氏染色,选取革兰氏阳性和触酶阴性菌株,于25～32 ℃厌氧培养48 h保存备用。

1.2.2具有降解亚硝酸盐能力菌株筛选将上述分离到的乳酸菌菌株按10 mL/kg接种量取种龄为18 h的种子,接种于200 mL含125 μg/mL NaNO2,pH6.0的液体MRS培养基中,30 ℃厌氧培养。24 h后,检测培养基中的NaNO2含量,用亚硝酸盐降解率来表示菌株降解亚硝酸盐的能力。亚硝酸盐含量测定方法参考国标盐酸萘乙二胺法[12]。亚硝酸盐降解率根据以下公式计算:

亚硝酸盐降解率(%)=最初亚硝酸盐含量-残留的亚硝酸盐含量/最初亚硝酸盐含量×100

1.2.3筛选菌株发酵特性测试以生产发酵香肠为目标,通过耐盐性实验、耐硝性实验、24 h产酸能力实验、发酵葡萄糖产气实验、产H2S实验、产粘液实验、氨基酸脱羧酶实验、精氨酸产胺实验,进一步筛选符合肉品发酵要求的乳酸菌菌株,实验方法参照文献[9]。

1.2.4筛选菌株的16S rDNA全序列分析将按上述方法筛选获得的菌株进行培养,提取菌株的DNA,采用16S rDNA细菌通用引物进行扩增、测序,测序工作由中美泰和生物技术有限公司完成。所得序列在GenBank数据库中利用BLAST进行在线同源性比对,并将比对结果中最相似菌株序列进行系统发育树的构建。

1.2.5乳酸菌菌株在发酵香肠中的应用将原料肉去除不宜加工和影响产品质量的部分后,绞碎并按比例(瘦肉∶肥肉=8∶2)混合,按肉重加入2.8%盐、0.5%蔗糖、0.015% NaNO2、1%香辛料进行充分混合后,置于4 ℃环境下,腌制24 h。然后按肉重2%进行接种处于对数生长期的发酵剂,使接种量达到106CFU/g以上。接种后的肉料,充填于猪肠衣内。经灌肠后的湿香肠,在55 ℃短暂烘干肠衣外部水分后置于30 ℃恒温恒湿培养箱中进行24 h发酵。发酵结束后,进行14 d的干燥脱水(10 ℃、相对湿度70%)、成熟(15 d),待香肠成熟后即开始贮藏实验。实验是模拟在日常销售的情况下,评价香肠的感官变化,因此贮藏温度控制为20～30 ℃。

1.2.6发酵香肠在发酵期乳酸菌活菌数、pH、NaNO2含量测定在香肠发酵过程中,分别于0、4、8、12、16、20、24 h取样,测定其乳酸菌活菌数、pH、NaNO2含量。乳酸菌活菌数测定:样品在无菌条件下除去肠衣,称取25 g样品,剪碎后加入225 mL灭菌生理盐水中,剧烈震荡30 min,混匀后梯度稀释,选择合适的稀释度倾注平板,30 ℃于MRS培养基中培养48 h后进行计数[13]。pH测定:将样品绞碎后,准确称取10.00 g加入90 mL蒸馏水中,将样品分散乳化,静置30 min后过滤,取滤液用酸度计进行pH的测定。NaNO2含量测定方法参照1.2.2。

1.2.7发酵香肠贮藏过程中的感官评价选择香肠的中间部位,将样品切为5 mm左右的薄片,10位食品专业的人员组成感官评定小组,以色泽20分、外观20分、组织状态30分、风味30分为标准对贮藏期间的发酵香肠进行感官评价,分数汇总后,取平均值作为发酵香肠的感官评分,评分标准见表1。

表1　发酵香肠感官评价标准

1.2.8发酵香肠贮藏过程中霉菌、酵母菌、肉毒梭状芽孢杆菌的检测分别检测贮藏第0周(香肠成熟时)、1周(第7 d)、2周(第14 d)、3周(第21 d)的菌落总数、大肠菌群、霉菌及酵母菌、肉毒梭状芽孢杆菌数量,具体检测方法参照国标[14-17]。

1.3数据处理

运用Excel和SPSS 16.0软件进行统计分析。

2　结果与分析

2.1乳酸菌的初步筛选

从不同产地的农家自制泡菜中,初步分离到12株能够在添加了CaCO3的固体MRS培养基中生长并产生溶钙圈的菌,对分离得到的各菌株用显微镜观察其菌体形态,同时进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验,结果见表2。

表2　初筛菌株鉴定结果

注:+表示阳性结果,-表示阴性结果;表3同。

如表2结果显示,12株菌中除T3为革兰氏阴性菌外,其他均为革兰氏阳性菌且过氧化氢酶反应阴性,初步确定11株菌均为乳酸菌。

2.2具有降解亚硝酸盐能力菌株筛选

对11株分离到的乳酸菌菌株用含有亚硝酸盐的MRS液体培养基培养,进一步筛选具有降解亚硝酸盐能力的菌株,最终筛选到降解效果较好(降解率超过50%)的6株菌(图1),其中编号为L1的菌株降解效果最好,亚硝酸盐降解率达到78.77%。

图1　菌株亚硝酸盐降解率Fig.1　Nitrite degradation of lactic acid bacteria

2.3菌株发酵特性测试

以肉品发酵剂所需特性为筛选评价目标,筛选满足能耐受6%NaCl和150 mg/kg NaNO2、24 h产酸能力较强、发酵葡萄糖不产气、不产H2S、水解精氨酸不产氨、不具有氨基酸脱羧酶活性、不产粘液、不具有分解脂肪和蛋白质的能力、不产H2O2、能够抑制致病菌和腐败菌的生长等条件的优良菌株。结果见表3,综合各项评价指标,菌株L1、W、T1符合筛选标准。结合降解亚硝酸盐实验结果,最终选取菌株L1为最优的肉品发酵剂,进行菌株鉴定。

表3　菌株发酵特性测定

2.4L1菌株的16S rDNA全序列分析

序列比对结果见图2,在比对匹配度最高的结果中,所测得的菌株L1的16S rDNA序列部分与Lactobacillussp.乳酸杆菌属的不同菌种的16S rDNA序列有很高的同源性。其中,在与已知菌种的匹配中,与鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)的序列相似度最高,因此确定L1菌株为LGG。LGG是全球广受关注的益生菌之一,该菌相对于其他种类的益生菌有更强的动物消化道环境耐受能力和肠道定植能力,具有调节肠道菌群、预防和治疗腹泻和提高机体免疫力等功能[18-20]。目前对于LGG的开发多见于发酵乳制品和益生菌制剂,而其在发酵肉质品中的应用的研究还较少。因此,接下来将以LGG为发酵剂应用于发酵香肠中,进一步检测其在肉制品中的亚硝酸盐降解能力。

图2　菌株16S rDNA序列比对结果Fig.2　Results of 16S rDNA sequence alignment

图3　香肠在发酵过程中的pH和乳酸菌活菌数变化Fig.3　pH and colony-forming unit in fermentation period of fermented sausage

2.5发酵香肠发酵过程中pH与乳酸菌活菌数变化

由图3可知,在发酵期间,香肠的pH随着发酵时间延长和乳酸菌菌数增加而快速下降,尤其是发酵8～12 h内降低速度最快,到24 h达到最低值4.91。乳酸菌的活菌数在香肠发酵过程中逐渐增加,在8～12 h这段时间里生长速度达到最大值,在发酵20 h时活菌数达到最大值,数量超过108CFU/g。

2.6发酵香肠发酵和贮藏过程中NaNO2含量变化

为验证LGG在发酵香肠中的降解亚硝酸盐的作用,实验检测了香肠在发酵过程中的NaNO2含量(图4),结果显示,NaNO2含量在发酵期的12～16 h期间快速降低,相对于pH的快速下降时期有一定的滞后,随后NaNO2含量减少速度逐渐放缓,到发酵结束时含量为12.2 mg/kg。在贮藏期间,NaNO2的含量继续降低,最终贮藏3周的发酵香肠的NaNO2含量为6.3 mg/kg,远低于国家规定的残留量30 mg/kg的标准。在进行肉制品加工过程中,亚硝酸盐作为发色剂在改善肉制品颜色方面具有重要作用,但过量使用亚硝酸盐会导致NO-大量残留,NO-在pH2～4的条件下可与次级胺类物质可形成亚硝胺这种强致癌物质,已有多项研究发现亚硝胺能诱导实验动物发生癌变,特别是消化系统癌症,例如食道癌、胃癌、结肠癌等。随着人们对食品安全意识的提高,多项研究致力于开发能取代亚硝酸盐的安全且高效的添加剂,研究发现,乳酸菌通过产生乳酸使肉制品的pH降低,生成游离亚硝酸,随后分解为NO,而NO可与肉中的肌红蛋白结合形成对热稳定的玫瑰色的亚硝基肌红蛋白(NO-Hb),从而赋予产品明亮的鲜红色,同时亚硝酸盐分解还有利于提高产品质量和安全性[21-22]。

图4　发酵香肠在发酵和贮藏过程中的NaNO2含量Fig.4　Concentration of NaNO2 in fermentation period and storage period of fermented sausage

2.7发酵香肠的感官评定

分别于贮藏开始时、第1周、第2周、第3周时对发酵香肠进行感官评定,感官评分为10位评定人员打分的平均分。由表4可知,在发酵香肠的贮藏期间,发酵香肠的感官评分随贮藏时间延长而逐渐下降,当发酵香肠贮藏进行到第3周时,各组发酵香肠的颜色变为灰红,光泽变淡,切面光泽略微发暗,与贮藏初期相比弹性略微下降,但气味正常,有淡淡的芳香,仍可食用。

表4　发酵香肠感官评定结果

2.8香肠贮藏期内腐败菌与致病菌检测

由表5中数据可知,发酵香肠在贮藏期内由于水活度较低和乳酸菌生成乳酸造成的pH较低的环境,使得大肠菌群、霉菌和酵母菌以及肉毒梭状芽孢杆菌等微生物生长受到抑制,各项微生物指标符合国家标准(菌落总数≤50000 CFU/g,大肠菌群≤30 CFU/100 g,致病菌不得检出),由此可推测发酵香肠具有较高的安全性,不易受到外源性腐败菌和致病菌的污染,但由于整个产品未经高温蒸煮灭菌,仍存在被污染的风险,这需要对产品生产的原料的质量和生产环境的卫生要严格把关,以减少微生物污染的发生。

表5　香肠中腐败菌和致病菌检测

3　结论

本研究从酸菜中分离到了1株具有较好的降解亚硝酸盐能力,且适于肉品发酵的乳酸菌菌株,16S rDNA全序列分析鉴定为鼠李糖乳杆菌。以鼠李糖乳杆菌为发酵剂生产的发酵香肠在发酵期结束时的NaNO2含量为12.2 mg/kg。贮藏期间香肠的NaNO2含量继续降低,最终贮藏3周的发酵香肠的NaNO2含量为6.3 mg/kg,远低于国家规定的残留量30 mg/kg的标准,说明鼠李糖乳杆菌在发酵肉制品中具有较好的亚硝酸盐降解能力,同时微生物指标也证明了此条件生产的发酵香肠安全可靠。此研究为今后的鼠李糖乳杆菌在加工生产品质优良、安全的发酵肉制品的开发应用提供理论依据。

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Isolation and identification of nitrite-degrading lactic acid bacteria from pickles and application in fermented sausage

CUI Jue1,2,SUN Hui-gang1,2,ZHU Zhao-li1,LOU Xue-lian1

(1.College of Food Engineering,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221111,China;2.Jiangsu Key Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221111,China)

Objective:To screen lactic acid bacteria from pickles,which could decompose nitrite in sausage. Methods:At first,lactic acid bacteria were screened from 15 different regional pickles,using MRS medium which add 0.3% CaCO3. Secondly,further experiments were executed according to nitrate degradation efficiency and standards of meat starter,and the bacterial strain which acquired from experiment was identified by using 16S rRNA encoding gene(16S rDNA)sequence.At last,fermented sausages were produced using the lactic acid bacteria asa starter,and concentrations of NaNO2in fermentation and storage period were detected. Results:One strain of lactic acid bacteria meetsthe standards,and it was identified to be 100% similar toLactobacillusrhamnosusGG. The nitrite concentration in fermented sausage was 12.2 mg/kg. At the same time,the results of microbiological detection demonstrated that with this condition,quality of the fermented sausage was safe.Conclusion:LactobacillusrhamnosusGG could significantly eliminate the nitrite in fermented sausage,and could be used as an efficient and healthy starter in fermented sausage production.

pickle;lactic acid bacteria;nitrite;fermented sausage

2015-12-25

崔珏(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：食品功能因子开发与食品质量控制，E-mail：cuijue1980@hotmail.com。

徐州工程学院自然科学培育项目(XKY2011111)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)18-0251-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.039