枸杞子多糖通过改善氧化应激延缓疲劳作用的研究

刘雨萌,金元宝,孟凡欣,于　浩

(1.吉林大学动物科学学院,吉林长春 130062;2.吉林大学珠海学院,广东珠海 519041)



枸杞子多糖通过改善氧化应激延缓疲劳作用的研究

刘雨萌1,2,金元宝2,孟凡欣2,于浩1,*

(1.吉林大学动物科学学院,吉林长春 130062;2.吉林大学珠海学院,广东珠海 519041)

本文研究枸杞子多糖(LBP)对小鼠疲劳的延缓作用及机制。将昆明种小鼠分为空白对照组(给予生理盐水)和高、中、低剂量枸杞子多糖处理组(剂量分别为100、50和25 mg/kg/day),灌胃给药2周,通过跑步、疲劳转棒和负重游泳实验考察枸杞子多糖对小鼠的抗疲劳作用,并对运动后小鼠体内肝糖原、肌糖原以及血清、肝脏和肌肉中抗氧化指标进行检测。实验结果表明,LBP可以明显延长小鼠的运动时间,增加小鼠肝糖原和肌糖原含量,同时明显提高血清、肝脏和肌肉中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,显著降低肝脏和肌肉中丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量及血清中MDA含量。LBP具有延缓疲劳的作用,其机制可能是减弱氧化应激和提高糖原含量。

枸杞子多糖,抗疲劳,氧化应激

随着社会的进步,人们生活节奏不断加快,疲劳已成为一种普遍的社会现象。作为一种生理现象,疲劳是指身体机能不能持续在特定水平或者整体能维持预定的运动强度而出现的一种状态[1],疲劳发生后如果得不到及时消除,将会逐渐积累,最终导致过劳,使机体发生内分泌紊乱,免疫力下降,甚至出现器质性病变[2],因而延缓疲劳发生和促进疲劳恢复是当今社会研究的热点。

枸杞子是茄科植物宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)的干燥成熟果实。枸杞子作为一种传统名贵中草药,性甘平,中医上其主要药理作用为补肾养阴,治虚劳消渴[3]。在中国传统中医药学中,枸杞子被用于多种补益方剂中。2002年,枸杞子被中国卫生部收录在药食两用中草药名单中[4]。

枸杞子中含有多种活性成分,其中研究最多的有效成分为枸杞子多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides,LBP),LBP是一种酸性杂多糖和多肽或者蛋白质复合而成的多糖。LBP具有多种生物活性,如缓解机体疲劳,降低血糖,抗缺氧,提高机体免疫力,延缓衰老等[5-6]。目前已有研究表明LBP具有缓解疲劳的作用,但由于疲劳发生机制的复杂性,LBP对其机制的研究并不全面详细。氧化应激是指生物体内氧化-还原系统处于失衡状态,氧自由基产生过多,过多的氧自由基会对生物体内的细胞和组织造成损伤,研究表明,氧化应激对疲劳的发生起着非常重要的作用[7],本文将从氧化应激方面着手进行LBP抗疲劳的机制研究。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号:20150404)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(批号:20150404)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号:20150406)、ROS试剂盒(批号:20150406)、肝糖原测定试剂盒(批号:20150410)和肌糖原测定试剂盒(批号:20150402)购自南京建成生物工程研究所;枸杞子购买自宁夏省中宁县,批号:20140503;健康成年昆明种小鼠160只,体重18～22 g,雄性,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,清洁级,实验动物质量合格证号:SCXK(吉)2014-0005,在22～25 ℃、相对湿度40%～60%的环境中饲养,自由饮食,小鼠饲养1周后进行实验。

RE52-05型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;XSC型小鼠恒温游泳池淮北正华生物仪器设备有限公司;YYAL204-IC型电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司;DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机宁波新芝生物科技股份有限公司;TL-16R型台式高速冷冻离心机上海市离心机机械研究所;756MC型紫外-可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司;360型傅里叶红外光谱仪美国Nicolet公司。

1.2实验方法

1.2.1枸杞子多糖的提取称取一定量的枸杞子,加入10倍水量,于100 ℃加热回流提取2 h,提取温度,冷却后于离心温度 4000 r/min离心10 min,收集上清液低温减压浓缩。采用Sevag法对提取液进行反复除蛋白,至无蛋白层产生为止[8]。减压浓缩蒸发提取液中含有的有机溶剂,采用4倍体积乙醇对提取液4 ℃醇沉,收集沉淀,冷冻干燥得枸杞子多糖,备用。

1.2.2LBP傅里叶红外光谱分析采用蒽酮硫酸法测定枸杞子提取多糖的含量,同时采用傅里叶红外光谱仪对LBP进行光谱扫描,扫描范围为4000～500 cm-1,并对LBP进行紫外区扫描,扫描波长为200～400 nm。

1.2.3小鼠疲劳转棒实验40只昆明种小鼠,雄性,随机分为4组,每组10只,分为空白组(给予相应的生理盐水)和LBP高、中、低剂量处理组(剂量分别为100、50和25 mg/kg/day),灌胃给药2周,末次给药1 h后,将各组小鼠分别放在疲劳转棒仪上,使肌肉处于静力紧张状态,转速设为20 r/min。各组小鼠进行实验前,对其进行训练,在各小鼠从转棒上跌落3次后,开始记录小鼠由于肌肉疲劳从转棒上跌下的时间。

1.2.4小鼠跑步实验40只昆明种小鼠,雄性,随机分为4组,每组10只,分为LBP高、中、低剂量灌胃组(剂量分别为100、50和25 mg/kg/day)和空白组(给予相应的生理盐水),灌胃给药2周,末次给药1 h后,将小鼠置于FT-200动物跑步机中。先放置好动物,对小鼠进行训练,使其了解逃离带电区域后,将转速设为30 r/min,电流调到最高,以小鼠被连续电击3次以上后,小鼠不能起身的时间记录为小鼠跑步时间。

1.2.5小鼠负重游泳实验40只昆明种小鼠,雄性,随机分为4组,每组10只,分为LBP高、中、低剂量组(剂量分别为100、50和25 mg/kg/day)和空白组(给予相应的生理盐水),灌胃给药2周,末次给药1 h后,每组鼠尾部系以体重10%的负荷,放入水温(27±1) ℃,水深为小鼠3倍体长的桶式游泳池中(d=50 cm),测定各组小鼠持续游泳力竭时间,以小鼠头部沉入水中5 s而不能浮出水面的时间为持续游泳时间。

1.2.6血样和组织样本采集40只昆明种小鼠,雄性,随机分为4组,每组10只,分为LBP高、中、低剂量组(剂量分别为100、50和25 mg/kg/day)和空白组(给予相应的生理盐水),灌胃给药2周,末次给药1 h后,每组进行20 min被迫游泳,于游泳结束5 min后,眼眶静脉取血,解剖取肝脏和肌肉,-80 ℃保存备用。

1.2.7小鼠运动后肝糖原和肌糖原含量的测定按照相关试剂盒使用方法,对固定时间游泳后小鼠肝脏和肌肉中糖原的含量进行检测。

1.2.8血清、肝脏和肌肉抗氧化指标检测肌肉和肝脏组织加入生理盐水研磨搅碎,之后4000 r/min 离心10 min,采用考马斯亮蓝试剂盒测定上清液中的蛋白浓度,之后参照试剂盒的方法测定SOD、GSH-Px活性和MDA和ROS含量,其中,ROS为荧光检测,激发波长500 nm,发射波长为525 nm,最后以单位蛋白内荧光强度表示ROS含量。

2　结果与分析

2.1枸杞子多糖成分分析和表征

采用蒽酮硫酸法测得枸杞子多糖含量为1.023%,同时分别对LBP进行了紫外光谱和傅里叶红外光谱扫描,其中傅里叶光谱扫描范围为4000～500 cm-1,结果如图1和图2显示。图1显示LBP在260 nm和280 nm处没有明显吸收峰,表明LBP中蛋白和核酸含量极低。并且已知不同的官能团的红外特征峰是不同的,通过对红外光谱图分析可以得到多糖中所具有的官能团。LBP在3400 cm-1处有强烈的O-H键伸缩振动,在2930 cm-1为C-H键的伸缩振动,1650 cm-1为C=O键的伸缩振动,在950～1200 cm-1表示有C-O-C和C-O-H键的伸缩振动。

(mg/kg)处理前体重(g)灌胃1周后灌胃2周后空白组020.58±1.2224.02±2.3227.22±1.26LBP剂量组2520.65±0.8925.88±3.2228.78±5.205020.48±1.1626.22±3.0228.75±5.2210020.66±2.0126.93±2.1529.21±4.36

图1　LBP的紫外吸收光谱图Fig.1　UV-spectrometry of LBP

图2　LBP傅里叶红外光谱图Fig.2　Fourier infrared spectrogram of LBP

2.2LBP对模型小鼠体重的影响

由表1可知,在给药2周期间,LBP对小鼠的体重并无影响。

2.3LBP对小鼠转棒时间的影响

如图3所示,与空白组相比,连续对小鼠分别灌胃50 mg/kg和100 mg/kg剂量的LBP 2周可以显著提高小鼠的转棒时间(p<0.01),说明LBP可以延缓小鼠疲劳的发生。

图3　LBP对小鼠转棒时间的影响Fig.3　The effects of LBP on rotarod time注:与空白组相比,** p<0.01;图5同。

2.4LBP对小鼠跑步时间的影响

结果如图4所示。小鼠灌胃给予2周LBP后,高、中、低剂量组均可明显提高小鼠的跑步时间,与空白组相比,中剂量和高剂量组分别将跑步时间延长113.5%(p<0.01)和116.3%(p<0.01),说明LBP可以延缓小鼠疲劳的发生。

图4　LBP对小鼠跑步时间的影响Fig.4　The effects of LBP on running time注:与空白组相比,* p<0.05,** p<0.01。

2.5LBP对小鼠负重游泳时间的影响

小鼠灌胃给予LBP两周后,通过负重游泳实验考察LBP对小鼠疲劳的影响,结果如图5所示。结果显示,50 mg/kg和100 mg/kg可以显著提高小鼠的负重游泳时间,与空白组相比,分别提高了65.3%(p<0.01)和113.33%(p<0.01),说明LBP可以延长小鼠疲劳的发生。

图5　LBP对小鼠负重游泳时间的影响Fig.5　The effects of LBP on swimming time

2.6LBP对小鼠肝糖原和肌糖原含量的影响

在运动过程中,糖是肌肉组织的重要能量来源,糖原的储量影响机体运动能力。由表2可知,与空白组相比,LBP低、中、高剂量组均能够明显增加小鼠肝糖原和肌糖原储备能力。与空白组相比,LBP低、中、高剂量组小鼠中肝糖原的含量分别增加了38.12%、51.16%(p<0.05)和66.23%(p<0.01),而肌糖原分别增加了6.55%、15.69%(p<0.05)和26.13%(p<0.05),结果表明LBP可以显著提高小鼠体内肝糖原和肌糖原的储备能力,进而增强小鼠的运动能力,减缓疲劳的发生。

Table 3The effect of LBP on the activities of SOD and GSH-Px,and the levels of

空白组LBP剂量组(mg/kg)2550100血清MDA(nmol/mL)33.25±9.8725.78±11.0825.45±10.90*22.04±7.82**SOD(U/mL)155.52±36.22236.80±41.51*243.34±48.20*259.12±36.92**GSH-Px(μmol/mL)132.38±41.35247.19±42.11*280.06±34.96**256.04±59.25**肝脏MDA(nmol/mgprot)46.25±14.2539.00±16.24*32.12±18.24*28.95±10.25**ROS(FI/gprot)1987±2871628±3121251±219**1188±232**SOD(U/mgprot)122.15±32.10141.05±35.47*156.93±36.22*163.32±18.25**GSH-Px(μmol/gprot)28.38±7.1131.93±7.2839.14±4.84*37.24±10.09*肌肉MDA(nmol/mgprot)1.54±0.211.26±0.15*1.05±0.22*1.09±0.25*ROS(FI/gprot)18005±201215563±1954*13256±2149**10243±1385**SOD(U/mgprot)82.13±19.1296.89±10.48*110.43±12.78*116.36±17.29**GSH-Px(μmol/gprot)29.12±3.6934.34±5.7137.24±4.01**38.10±4.86**

表2　LBP对小鼠肝糖原和肌糖原的影响

注:与空白组相比,*p<0.05,**p<0.01;表3同。

2.7LBP对运动后小鼠抗氧化能力的影响

研究表明,氧化应激对疲劳的发生起着非常重要的影响,运动等应激可导致机体自由基产生过多,自由基攻击细胞膜及线粒体等细胞器使其损伤,从而引发细胞代谢和机能紊乱,使工作能力下降引发疲劳。表3结果表明,LBP可以提高抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性,并且降低过氧脂质化物ROS和MDA的含量,与空白组相比,具有显著差异性。与空白组相比,LBP高剂量组血清中SOD、GSH-Px活性分别提高了66.6%和93.4%(p<0.01),而血清中MDA含量降低了33.7%(p<0.01)。LBP可以显著加强肝脏和肌肉中抗氧化酶 SOD和GSH-Px的活性,显著降低肝脏和肌肉中MDA和ROS含量,与空白组相比,其中100 mg/kg LBP剂量组肝脏中的MDA和ROS含量分别降低了37.4%和40.2%,肌肉中的MDA和ROS含量分别降低了29.2%和43.1%。

3　讨论

疲劳的最直接和最客观的表现是运动耐力的下降,本文通过小鼠疲劳转棒、跑步和负重游泳实验评价LBP抗疲劳作用。灌胃2周(剂量)LBP后,小鼠的运动耐力有明显的提高,由于小鼠间的个体差异性比较大,导致各组数据的偏差较大,通过双t-t检验显著性水平,与空白组相比仍具有显著性差异,表明LBP能够延缓疲劳的发生。

在运动过程中,糖是肌肉组织的重要能量来源。在机体进行短时间大强度运动时肌肉组织的能量绝大部分由糖代谢供给[9-10]。肌糖原的储量和代谢能力是决定耐力的重要因素,大量的研究表明运动导致的体力衰竭总是和肌糖原的耗竭同时发生的。随着肌糖原消耗的不断增加,机体为维持血糖水平,将动用肝糖原而导致肝糖原减少[10]。因此,肝糖原和肌糖原含量是反映疲劳程度的敏感指标。通过对小鼠耐力的考察实验以及肌糖原和肝糖原的测定,结果表明,LBP具有延缓疲劳的效果。

在生物体内,ROS可以作为信号分子参与葡萄糖和脂质的代谢[11],但是运动等应激可导致机体自由基产生过多,造成机体氧化-还原系统的失衡,进而影响肌肉对葡萄糖的摄取[12];同时,自由基会攻击细胞膜和线粒体等细胞器,进而导致其损伤,从而引发细胞代谢和机能紊乱,使工作能力下降引发疲劳[13]。通过对小鼠体内抗氧化酶活性和氧自由基等的检测,表明LBP可以通过提高机体内的抗氧化能力和减少氧自由基,进而改善氧化应激对机体的损伤和延长小鼠的运动时间。

4　结论

通过疲劳转棒实验、跑步实验和负重游泳实验,表明LBP可以延长小鼠的运动时间;同时LBP可以提高小鼠体内肝糖原和肌糖原的储备能力,进一步表明LBP具有缓解疲劳的作用。在运动过程中,大量ROS产生,造成机体氧化-还原系统的失衡,对机体造成损伤,引发疲劳,LBP可以提高机体的抗氧化能力,减少氧自由基的产生,可以通过改善氧化应激进而缓解疲劳,但是由于疲劳产生的机制及其复杂,LBP具体缓解疲劳的机制还需进一步研究。

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Anti-fatigue activity ofLyciumbarbarumpolysaccharides in mice by attenuating oxidative stress

LIU Yu-meng1,2,JIN Yuan-bao2,MENG Fan-xin2,YU Hao1,*

(1.College of Animal Science,Jilin University,Changchun 130062,China 2.Zhuhai College of Jilin University,Zhuhai 519041,China)

The effect ofLyciumbarbarumpolysaccharide(LBP)on delaying fatigue via attenuating oxidative stress was studied in mice model. After 2-week LBP treatment with dose of 25,50 and 100 mg/kg,exercise time of the mice was detected via rotating rod test,forced swimming test,and forced running test. After 20 min swimming,the levels of hepatic glycogen,muscle glycogen,and some antioxidant indexes were detected in serum,liver,and muscle. LBP obviously prolonged exercise time,increased the levels of liver glycogen and muscle glycogen,enhanced the activities of SOD and GSH-Px,and decreased the levels of MDA and ROS in serum,liver and muscle. The anti-fatigue activity of LBP may be associated with attenuating oxidative,further increasing glycogen content in the mice.

Lyciumbarbarumpolysaccharides;anti-fatigue;oxidative stress

2016-01-06

刘雨萌(1986-)，女，硕士研究生，研究方向：生物制药，E-mail:269506310@qq.com。

于浩(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：分子遗传，E-mail:43032808@qq.com。

TS254.1

A

1002-0306(2016)18-0344-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.057