糙皮侧耳发酵液降解饲料中黄曲霉毒素B1的应用研究

胡常英, 杨何宝, 罗同阳, 王云鹏

(河北省微生物研究所， 保定 071051)



糙皮侧耳发酵液降解饲料中黄曲霉毒素B1的应用研究

胡常英, 杨何宝, 罗同阳, 王云鹏

(河北省微生物研究所， 保定 071051)

取自然条件下污染黄曲霉毒素B1的玉米、豆粕和花生粕饲料进行解毒试验。每种饲料选择3个黄曲霉毒素B1浓度(10.7～62.2 μg/kg)，按11‰比例加入糙皮侧耳浓缩发酵液，72 h降解率为39.5%～55.4%,168 h降解率为52.4%～75.5%。在模拟牛胃条件下，以豆粕饲料含不同浓度的黄曲霉毒素B1(15.7 μg/kg、30.5 μg/kg和48.9 μg/kg)为有毒源，糙皮侧耳浓缩发酵液添加11‰，24 h解毒率为25.5%、19%和17.4%，48 h解毒率为42.7%、33.1%和29% 。改变浓缩发酵液添加比例为7‰、9‰、11‰、13‰和15‰，降解时间36 h，解毒率为53.5%以下。

糙皮侧耳发酵液;降解;黄曲霉毒素B1

糙皮侧耳(PleurotusOstreatus)是一种含有丰富营养成分的食用菌，每100 g干菇含有粗蛋白约19.5 g，粗脂肪约3.8 g，碳水化合物50.2 g，粗纤维6.2 g，还有矿物质和多种维生素等[1-2]。菌体可以进行液体深层发酵培养，培养液中含有大量的多糖、酶、氨基酸及生理活性物质。发酵液酶中尤以3种酚氧化酶含量较高[3-4]。这些酶可用于食品保鲜，可用于降解多种化工颜料，对霉菌毒素也有降解作用[5]。

黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是霉菌毒素中的一种，也是毒性最强的一种[6]。张自强2009年对11省的1050个饲料样品调查发现，黄曲霉毒素污染率高达92.3%，黄曲霉毒素B1检出率高达73.3%，黄曲霉毒素超标率为55.1%[7]。动物饲用被黄曲霉毒素B1污染的饲料后，毒素主要集聚于肝脏，干扰肝脏正常代谢功能，肌体的生理生化反应严重受阻[8-10]。黄曲霉毒素B1可以通过家畜的分泌物传递，尤其母牛乳汁中最为常见，不但危害家畜本身，还以食物链方式危害人的身体健康[11]。为此，黄曲霉毒素B1毒害作用已经引起世界各国高度重视。目前，解除黄曲霉毒素B1危害可归纳为3种方法，即物理方法、化学方法和生物学法[6，11]。由于物理和化学方法均有不利方面，而生物学法降解毒素条件温和，不产生副作用(二次危害)，对营养成分不破坏，是当前推荐的方法，也是非常有发展前途的方法[12-14]。选用糙皮侧耳菌种进行液体深层发酵，发酵液用于降解黄曲霉毒素B1，降解效果良好，是一种值得深入研究和开发的生物解毒剂[5]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种糙皮侧耳JWEI113H，本研究所食用菌室保藏。

1.1.2自然污染的玉米饲料选取含有黄曲霉毒素B1量分别为10.7、35.4和58.1 μg/kg，3种玉米饲料，每一浓度取3个平行样进行试验。

1.1.3自然污染的豆粕饲料选取含有黄曲霉毒素B1量分别为15.7、30.5和48.9 μg/kg 3种豆粕饲料，每一浓度取3个平行样进行试验。

1.1.4自然污染花生粕饲料选取含有黄曲霉毒素B1量分别为15.5、35.4和62.2 μg/kg 3种花生粕饲料，每一浓度取3个平行样进行试验。

1.2浓缩发酵液制备

1.2.1斜面培养基马铃薯提取液、葡萄糖、琼脂。

1.2.2液体发酵培养基土豆淀粉60 g、蔗糖20 g、酵母膏2 g、(NH4)2SO43.0 g、KH2PO43 g、MgSO4.7 H2O 1.5 g、VB12 mg 、微量元素溶液55 mL、藜芦醇 450～550 μL/L、吐温80 0.1% pH 5.2。

1.2.3浓缩发酵液制备斜面菌种长好后接种于平皿培养基中，平皿中菌丝长到2/3面积，用直径8～10 mm玻璃管在接近外边缘位置取圆片菌丝接种于三角瓶中，每瓶接3～5片，26℃±1℃ 培养3～4 d为液体种子，按2%～3%比例接种到1000 L发酵罐中，通气培养9～11 d，取滤液，采用真空旋转薄膜浓缩器浓缩后备用。

1.3黄曲霉毒素B1降解试验方法

1)取11‰浓缩发酵液，均匀喷施在玉米、豆粕和花生粕饲料上，搅拌均匀，饲料表面应均匀被发酵液湿润和有液滴为好，保温在25℃～27℃条件下，进行解毒试验，降解时间为72 h～168 h，记录结果。

2)模拟牛胃条件对豆粕饲料解毒试验，加入11‰浓缩发酵液，降解时间为24～48 h,记录结果。

3)模拟牛胃条件对豆粕饲料解毒试验，分别加入7‰、9‰、11‰、13‰和15‰的糙皮侧耳浓缩发酵液，降解时间为36 h,记录结果。

1.4黄曲霉毒素B1抽提方法

AFB1提取参照GB—2008/ISO6651:2001。

1.5黄曲霉毒素B1测定方法

参照GB/17480—2008饲料中黄曲霉毒素B1的测定方法-酶联免疫吸附法。

2　结果与讨论

2.1玉米饲料中黄曲霉毒素B1降解试验

对玉米饲料毒素降解按11‰比例添加浓缩发酵液。试验的关键是保证二者的充分接触，必要时可采取在保证添加比例的前提下，对浓缩液进行稀释，增大液体量，使发酵液与饲料混合均匀，降解试验物料静止在26℃条件下进行，测定数据列于表1。

表1 发酵液降解玉米饲料中AFB1结果Table 1 Result of AFB1-degradation of corn feed byPleurotus ostreatus fermentation

注：所有表格中的测定数据为3个平行样的平均值

降解毒素反应72 h：1号样品降解率是54.2%，2号样品降解率是43.2%,3号样品降解率是40.3%；反应168 h 1号样品降解率是75.7%，2号样品降解率是62.1%,3号样品降解率是55.4%。从降解率分析，每一相等时间段降解速度不同，表现出随时间延长，降解速度下降趋势。

浓缩发酵液喷洒在玉米饲料上直接用于降解黄曲霉毒素B1，总体属于固体相，反应体系不利于生化反应进行，没有液体相互融的流动相环境，毒素底物密度分配不均匀，降解产物不易分散，阻遏正向反应进行；饲料中黄曲霉毒素B1附着量不均匀，部分玉米粒上毒素浓度很高，制约发酵液对毒素的降解速度。但有的籽粒上也可能没有沾附黄曲霉毒素B1，或者量很少，虽然发酵液与饲料接触充分，可能部分发酵液不能发挥作用，是导致降解效率下降的主要原因。

2.2豆粕饲料中黄曲霉毒素B1降解试验

按照浓缩发酵液降解玉米饲料黄曲霉毒素B1试验方法，添加11‰浓缩发酵液与豆粕饲料充分混匀，在不同时间测定毒素的剩余量，结果见表2。

表2 浓缩发酵液对豆粕饲料中AFB1降解结果Table 2 Result of AFB1-degradation of bean cake feed by Pleurotus ostreatus fermentation

浓缩发酵液对豆粕中黄曲霉毒素B1降解，因毒素含量高低不同降解率也不同，降解速率在72 h 前快，随时间延长降解速度下降。1号饲料前72 h降解率是55.4%，到168 h降解速率为71.3%，前后相等时间段降解速率下降39.5 %；2号饲料72 h降解率是41.3%，168 h为57.4%，前后相等时间段降解速率下降25.2%；3号饲料72 h降解率是39.5%，168 h为53.6%，前后相等时间段降解速率下降25.4%。降解规律与玉米饲料相似。

浓缩发酵液与有毒饲料混合后静止堆放的做法为静态降解法，从生物化学反应体系影响分析，效果远不如家禽家畜胃肠中蠕动状况下有利于反应进行和产物扩散，更不如在液体相中的生化反应容易进行。对饲料静态降解率低是正常的。

在生物法降解黄曲霉毒素B1机理研究中，有人认为其生物法降解实质是微生物细胞壁或是菌体对毒素的吸附作用。糙皮侧耳发酵液降解黄曲霉毒素B1毒性，发酵液中不含菌体，发酵液制备过程检测指标为蛋白，由此判断，糙皮侧耳发酵液降解黄曲霉毒素B1机理应是酶促反应过程。

2.3花生饲料中黄曲霉毒素B1降解试验

花生粕以其蛋白质含量高，资源丰富，是养殖业蛋白饲料的首选。正是因为其营养丰富，常被霉菌污染，黄曲霉毒素B1检出率高出一般饲料，每一样品的测定值也高于其它饲料数值。试验方法同玉米饲料降解相同，降解测定时间72～168 h，浓缩发酵液添加量11‰,环境温度26℃。不同时间黄曲霉毒素B1剩余量测定结果见表3。

表3 浓缩发酵液对花生粕中AFB1不同时间降解结果Table 3 Result of AFB1-degradation of peanuts cake feed by Pleurotus ostreatus fermentation

糙皮侧耳发酵液降解花生粕中黄曲霉毒素B1试验中，降解反应72 h，降解率分别为51.6%、43.5%和40.2%,168 h降解率为72.9%、57.6%和52.4%,降解规律与降解玉米饲料中毒素规律相同。继续延长降解时间，总量在增加，但降解速率逐渐下降。同样也表现了非液相状态下产物不利于扩散，反应物不易流动和产物的抑制作用等，不利于催化反应进行。

刘睿杰等选用巨大芽孢杆菌，采用固体发酵工艺去除花生粕中黄曲霉毒素B1毒性，黄曲霉毒素B1含量低于375 μg/kg，降解率高达68%，而且对花生粕营养成分没有不利影响[15]。赵丽红等选用枯草芽孢杆菌发酵降解玉米中黄曲霉毒素B1，取得了满意效果，当饲料中含黄曲霉毒素B170μg/kg，加入MLJ060霉立解，鸡的生产性能恢复到对照组的99.6%[16]。糙皮侧耳浓缩发酵液降解花生粕中黄曲霉毒素B1结果与二者的报道结果接近，反映了生物制剂降解黄曲霉毒素可行性和规律。

2.4模拟牛胃肠条件下发酵液降解AFB1试验

牛吃完草料后需要饮水，正常成牛每次需要饮用20 kg左右水，因此，牛的瘤胃中有60%～80%水分。模拟牛瘤胃条件环境：1)添加11‰浓缩发酵液于豆粕饲料中，存放于模拟容器中，揉搓、翻动和研磨，保持温度26℃，测定24～48 h的黄曲霉毒素B1剩余量，结果见表4；2)分别添加7‰、9‰、11‰、13‰和15‰浓缩发酵液于含黄曲霉毒素B1的豆粕饲料中，分别存放于模拟容器中，揉搓、翻动和研磨，保持温度26℃，降解时间36 h，测定黄曲霉毒素B1剩余量，测定结果列于表5。

表4 模拟牛胃浓缩发酵液对豆粕饲料中AFB1降解结果Table 4 Result of AFB1-degradation of bean cake feed byPleurotus ostreatus fermentation under the stomach of ox test

表5 浓缩发酵液添加量与豆粕饲料中AFB1降解相关性Table 5 The Cornelation between AFB1-degradation of bean cake feed and added to proportion of Pleurotus ostreatus fermentation

模拟牛瘤胃对饲料搅动、翻滚过程，饲料与发酵液充分混合，增加酶与底物毒素的接触概率和时间，搅动与翻滚分散了产物的集中度，产物不断扩散，避免产物大量集聚对酶促正向反应产生阻遏作用。1)添加11‰浓缩发酵液，24 h降解率是25.5%、19%和17.4%；48 h降解率是42.7%、33.1%和29%。2)降解36 h，添加7‰发酵液，降解率分别是24.2%、21.7%和18.8%；添加11‰发酵液降解率是36.9%、27.9%和25.6%；添加15‰发酵液降解率是53.5%、36.4%和37%。因此推测：如果将发酵液应用于牛胃肠内解毒，解毒效果应更好。牛胃、肠中产生大量酶系，有自身保护的解毒酶作用，这些酶与发酵液协同作用，能加快黄曲霉毒素B1降解速度。

3　结论

糙皮侧耳浓缩发酵液用于降解玉米、豆粕和花生粕饲料中黄曲霉毒素B1，毒素含量小于62.2 μg/kg时，浓缩发酵液按11‰比例与饲料混匀，降解72 h和168 h，降解率分别大于39.5%和52.4%， 72 h前降解速率明显高于72～168 h降解率；饲料中毒素基础含量越低，降解率越高。模仿牛胃肠条件降解豆粕饲料中黄曲霉毒素B1，毒素含量小于48.9 μg/kg，添加11‰浓缩发酵液，24 h降解率大于17.4%，48 h降解率大于29%；改变糙皮侧耳浓缩发酵液添加比例，降解率相应变化。

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Applied study on aflatoxin B1toxicity of the feed degraded by Pleurotus Ostreatus concentrated fermentation

HU Chang-ying, YANG He-bao, LUO Tong-yang, WANG Yun-peng

( Hebei Institute of Microbiology, Baoding 071051， China)

The materials for the AFB1toxicity-degradation test were natural AFB1of corn, bean cake and peanuts cake feed, the three AFB1concentrations (from 10.7 to 62.2μg/kg) were studied from every feed, taking the weight of the feed as the base, add to 11‰PleurotusOstreatusconcentrated fermentation. The rate of AFB1-degradation increased from 39.5% to 55.4% when 72 hours; the rate of AFB1-degradation increased from 52.4% to 75.5% when 168 hours. In imitate of the stomach of ox test, the test material was bean cake containing AFB1with different coucentrations such as 15.7 μg/kg, 30.5 μg/kg and 48.9 μg/kg, taking the weight of the feed as the base, 11%PleurotusOstreatusconcentrated fermentation added, the rate of AFB1-degradation are 25.5%, 19% and 17.4% when 24 hours respectively, the rate of AFB1-degradtion are 42.7%, 33.1% and 29% when 48 hours respectively, add to proportion ofPleurotusOstreatusconcentrated fermenta tion are 7‰, 9‰, 11‰, 13‰ and 15‰, the rate of AFB1-degradation are at 53.5% when 36 hours.

Pleurotusostreatusfermentation; degradation; aflatoxin B1

2015-12-28；

2016-01-22

河北省省级科技计划资助项目(13252804D)

胡常英，研究员，主要研究方向为酶工程，E_mail:qimingxing105@126.com

S816.8

B

2095-1736(2016)05-0103-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.103