类风湿关节炎与IL-1RAP基因多态性关联的研究

刘曦 胡成栋 李盼 张源潮 杨清锐

类风湿关节炎与IL-1RAP基因多态性关联的研究

刘曦 胡成栋 李盼 张源潮 杨清锐

目的 探索IL-1RAP基因多态性与类风湿关节炎(RA)的关联性。方法 选取178例RA患者(RA组)及207例正常对照的全血标本，提取DNA、基因分型，对病例组与对照组IL-1RAP rs766442的等位基因频率、基因型进行分析。结果 IL-1RAP rs766442 基因型包括GG、GT、TT，RA组与正常对照组间三种基因型频率差异有统计学意义(P=0.038)、等位基因频率差异有统计学意义(P=0.018)。结论 携带T等位基因的RA患者出现RF-IgG阳性的几率可能较高，IL-1RAPrs766442的TT基因型可能为RA的易感基因。

类风湿关节炎；IL-1RAP基因

类风湿关节炎(RA)是一种以破坏性关节病变及关节滑膜炎为主要特征的慢性、侵袭性、进行性自身免疫性疾病，可导致非常高的致残、致畸率，其本质为由未知抗原刺激所引起的免疫反应[1-3]，导致局部关节滑膜组织及血循环中的免疫细胞活化，其产生大量炎性细胞因子是导致类风湿性关节炎病程进展的关键因素。滑膜组织和滑膜细胞中浸润的淋巴细胞、单核/巨噬细胞等通过旁分泌或自分泌的方式产生大量的炎性介质和细胞因子，参与RA的致病过程[4-6]。白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)作为体内最强的炎性介质之一，其能够介导多种炎性反应，生物学作用非常广泛。许多研究己经证明IL-1在类风湿关节炎发病的过程中具有非常重要的作用，它不仅参与滑膜炎症与血管翳的形成，而且在软骨与骨的破坏和修复中起重要作用，有研究表明IL-1基因多态性在决定RA的预后上起重要作用[7-9]。IL-1需要与受体结合后才能启动信号转导，发挥生物学功能，IL-1RAP不能单独与IL-1相结合，但可使IL-1RⅠ与IL-1的亲和能力增加，在IL-1与IL-1R的结合中扮演着重要角色。引起RA的病因非常多，一般认为由环境因素和遗传因素共同作用所诱发。因个体对类风湿性关节炎易感性程度不同，使得个体在微生物及其抗原等的诱导下产生自身免疫反应，导致关节软骨、滑膜等组织损伤，所以遗传因素在疾病的发生、发展中起着非常重要的作用，几乎决定了人体对于疾病发生的严重程度和疾病的易感程度。有相关研究通过对家系的调查发现类风湿关节炎的遗传因素高达60%[10]，异卵双生子共同患类风湿关节炎的几率约为13%，单卵双生子同患类风湿关节炎的几率约为27%，均比普通人群高。虽然类风湿关节炎非遗传性疾病，但是等位基因之间的差异有可能导致个体对疾病的免疫应答能力或易感性高低有别，在病原体及其他诱发因素的作用下患RA的几率可能会有所不同[11]。本文探讨IL-1RAP基因多态性与RA的关联性，进一步印证RA发病机制与遗传学的密切关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例组178例RA患者均来自中国北方汉族人群，来自河北省邯郸市中心医院，其中男42例，女136例;年龄18～64岁，平均年龄(41.2±2.7)岁。所有患者符合1987年ACR类风湿关节炎的诊断标准，排除DM/PM、SLE、甲状腺疾病、糖尿病等自身免疫性疾病。检测患者RF-IgA、RF-IgG、RF-IgM、抗CCP抗体、RA33、GPI抗体。正常对照组207例均为邯郸市中心医院体检中心健康中国北方汉族人，男54例，女153例；年龄23～65岁，平均年龄(41.2±2.9)岁。无自身免疫病、肿瘤、传染病等疾病，性别、年龄均与RA组匹配。

1.2 试验方法

1.2.1 标本收集:收集类风湿关节炎患者空腹静脉血2 ml置于抗凝采血管中，储存于-80℃冰箱待检。

1.2.2 提取DNA及DNA纯度测定:将提取的DNA采用比色法测定其纯度，OD260/OD280均在1.6～2.0，表明所提取的DNA中含蛋白质及其他杂质较少，纯度较高。

1.2.3 SYBR Green I染料法Real-time PCR熔解曲线法基因分型:建立反应体系，按所需反应的样本例数在EP管中加入相应体积的SYBR GreenⅠ、Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP Mix、dH2O、MgCl2、DMSO，短暂混匀、离心，再用移液器按反应体系分别加入PCR反应板各孔底部，依次加入三条引物、模板DNA后迅速密闭封口膜，上述操作均在冰上进行。将PCR反应板放入离心机短暂离心，3 000 rPm，离心1 min使混合液集中于底部。应用罗氏LightCycler480分析仪进行基因分型。见表1。

表1 引物

1.3 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件计算基因型、等位基因对疾病的相对危险度(odds ratio,OR)及95%可信区间(95% confidence intervals,CI) (SPSS Inc,Chicago,USA)。Hardy-Weinberg平衡(HWE)检验采用χ2分析，分析等位基因及基因型频率用卡方分析或 Fisher 精确概率分析(样本数据少于5时)及多重检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因型频率及等位基因频率在RA及正常人的分布 查阅NCBI网站，中国北京汉族人群IL-1RAP的SNP位点rs766442包括GG、GT、TT三种基因型，G/T等位基因频率比例为0.098/0.902，本实验178例RA患者中，GG基因型为0例，GT基因型为33例，TT基因型为145例，等位基因频率比例G/T为 0.093/0.907。207例正常对照组人群中，GG基因型为4例，GT基因型为56例，TT基因型为147例，等位基因频率比例G/T为0.152/0.848。2组间三种基因型频率(P=0.038)、等位基因频率(P=0.018)差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 IL-1RAP rs766442基因型和等位基因频率分布 例(%)

2.2G/T多态性与RF-IgA的关联 178例RA患者中RF-IgA阳性的为113例，RF-IgA阴性者为65例。其中RF-IgA阳性RA患者GT基因型为21例，TT基因型为92例，等位基因频率比例G/T为0.092/0.908。65例RF-IgA阴性RA患者GT基因型为12例，TT基因型为53例，等位基因频率比例G/T为0.093/0.907。2组间三种基因型频率(P=0.975)、等位基因频率(P=0.976)差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 IL-1RAP rs766442G/T多态性与RF-IgA的关联 例(%)

2.3 G/T多态性与RF-IgG的关联 162例RA患者中RF-IgG阳性的为138例，RF-IgG阴性者为40例。其中RF-IgG阳性RA患者GT基因型为21例，TT基因型为117例，等位基因频率比例G/T为0.076/0.924。37例RF-IgG阴性RA患者GT基因型为12例，TT基因型为28例，等位基因频率比例G/T为0.149/0.851。2组间三种基因型频率差异有统计学意义(P=0.046)，等位基因频率差异无统计学意义(P=0.0588)。见表4。

表4 IL-1RAP rs766442G/T多态性与RF-IgG的关联 例(%)

2.4G/T多态性与RF-IgM的关联 162例RA患者中RF-IgM阳性的为158例，RF-IgM阴性者为20例。其中RF-IgM阳性RA患者GT基因型为30例，TT基因型为128例，等位基因频率比例G/T为0.094/0.906。20例RF-IgM阴性RA患者GT基因型为3例，TT基因型为17例，等位基因频率比例G/T为0.083/0.917。2组间三种基因型频率(P=0.830)、等位基因频率(P=0.839)差异无统计学意义。见表5。

表5 IL-1RAP rs766442G/T多态性与RF-IgM的关联 例(%)

3 讨论

3.1IL-1RAP在类风湿关节炎发病过程中的作用IL-1在参与调节机体免疫应答过程中，其作为炎性反应中一种重要的炎性细胞因子,需要与受体结合后才能启动信号传导，发挥其生物学功能[12-16]。IL-1受体家族包括3型:IL-1RⅠ、IL-1RⅡ和IL-1RAP，均属于免疫球蛋白超家族。IL-1RAP分子量为66kD，是一种拥有570个氨基酸的糖蛋白，含有20个氨基酸的信号肽，29个氨基酸的跨膜区，340个氨基酸的胞外区和181个氨基酸的胞浆区，基因位置为3q28[17-20]。在IL-1受体家族中，IL-1RⅠ是IL-1的功能性受体，IL-1与之结合后可产生生物学作用,而IL-1RⅡ为IL-1的伪受体,与IL-1 结合后不能转导信号，从而不能产生物学效应。IL-1RAP不能够单独与IL-1相结合，但它在IL-1与IL-1R的结合中扮演着重要角色：一方面，同时表达IL-1RⅠ和IL-1RAP的细胞株与IL-1的亲和能力高于单表达IL-1RI的细胞株与IL-1的亲和能力，另一方面，有了IL-1RAP参与，IL-1RⅡ和IL-1的亲和力增加超过20倍[21-23]。除此以外，IL-1RAP在IL-1信号转导中发挥重要作用：实际上IL-1RI相关激酶(IRAK)是通过与IL-1RI复合物中的IL-1RAP相互结合后发生磷酸化，磷酸化后的IRAK与TRAF6 结合, 形成一种复合物，导致转录因子NF-κB的激活和核易位，然后产生一系列炎性级联反应。因此，IL-1RAP在TLRs信号转导通路中及炎性因子IL-1的生物学功能中发挥着关键作用，可能直接或间接参与了RA的进展与转归过程。

3.2IL-1RAP基因多态性与类风湿关节炎的关联 随着对类风湿关节炎相关遗传学研究的深入，已证实其 与人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)有相关性，HLA-Ⅱ基因具有高度的多态性，它是参与机体免疫应答和特异性识别的关键成分，DR、DP和DQ三类基因均与RA的发病相关。随着人们对基因研究技术的不断进展，已有更多学者将研究方向转向了非MHC基因。SNPs是在基因组水平上由单个核苷酸变异所导致的DNA序列的多态性，其中包括了单个碱基的插入、颠换、转换或缺失。外显子区域中的基因突变可影响蛋白质的表达，启动子区域中的基因突变可直接影响核基因的表达水平，内含子区域中基因的突变则可影响剪接的结果。

IL-1RAPrs766442位点包括GG、GT、TT三种基因型，本实验中RA患者未检测出GG基因型，RA组和正常对照组之间等位基因频率(P=0.018)、基因型频率(P=0.038)差异均有统计学意义(P<0.05)。RF-IgG阳性的类风湿关节炎患者TT基因型比例(84.8%)高于RF-IgG阴性的类风湿关节炎患者(70.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)。因此 ，IL-1RAPrs766442TT基因型可能为类风湿关节炎的易感基因，携带T等位基因的类风湿关节炎患者RF-IgG阳性概率可能较高，这有待于扩大样本量进一步验证。

对于类风湿关节炎发病机制相关的候选基因的遗传变异进行研究，可能对患者的疾病进展及预后作出评估和指导临床治疗，还可能发现治疗类风湿关节炎的有效靶点，因此对于类风湿关节炎的遗传学进行研究，使得类风湿关节炎临床诊疗有重要的指导意义。

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Correlation between rheumatoid arthritis and IL-1 RAP gene polymorphism

LIUXi*,HUChengdong,LIPan,etal.

*DepartmentofImmunity,CentralHospitalofHandanCiity,Hebei,Handan056001,China

Objective To investigate the correlation between rheumatoid arthritis (RA) and IL-1 RAP gene polymorphism.Methods One hundred and seventy-eight patients with RA (case group) and 207 healthy subjects (control group) were enrolled in the study.The whole blood specimens of all the subjects were taken,then DNA was extracted for genotyping.The allele frequency of IL-1RAP rs766442 and genotypes were detected and statistically analyzed.Results There were significant differences in the IL-1 RAP rs766442 genotype frequency including GG, GT, TT between two groups (P<0.05),moreover,therewasasignificantdifferenceinallelefrequencybetweentwogroups(P<0.05).Conclusion The RA patients with T allelic gene have higher probability to present positive RF-IgG, and the TT genotype of IL-1RAP rs766442 may be the predisposing gene of RA.

rheumatoid arthritis; IL-1RAP gene

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.05.014 ·论著·

056001 河北省邯郸市中心医院免疫科(刘曦)，骨二科(胡成栋、李盼)；山东省立医院风湿免疫科(张源潮、杨清锐)

R

A

1002-7386(2017)05-0694-04

2016-09-11)