人巨细胞病毒UL145相互作用蛋白的筛选和功能分析

邹飞，王爽，吴思，孙峥嵘

（1.中国医科大学附属盛京医院生物样本库，沈阳110004；2.吉林大学第一医院儿科，长春130021）

人巨细胞病毒UL145相互作用蛋白的筛选和功能分析

邹飞1，2，王爽1，吴思1，孙峥嵘1

（1.中国医科大学附属盛京医院生物样本库，沈阳110004；2.吉林大学第一医院儿科，长春130021）

目的应用酵母双杂交系统筛选与人巨细胞病毒（HCMV）UL145编码蛋白相互作用的来源于人胎脑cDNA文库的组织蛋白。方法采用聚合酶链式反应扩增HCMVUL145片段，酶切及纯化扩增的目的片段及酵母表达载体pGBKT7，连接HCMV UL145片段及载体pGBKT7，将连接后的重组诱饵表达载体pGBKT7⁃UL145转化到酵母菌AH109中，再将人胎脑文库DNA也转化到酵母AH109中，筛选与HCMV UL145编码蛋白相互作用的蛋白，并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果最终确认多个克隆与HCMV UL145编码蛋白相互作用，BLAST结果显示3个与FOXG1高度同源。结论利用酵母双杂交系统成功筛选出与HCMV UL145编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库蛋白FOXG1，推测该目的蛋白在HCMV感染所致神经系统损伤过程中起重要作用。

人巨细胞病毒；UL145蛋白；酵母双杂交系统；人胎脑cDNA文库

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）属疱疹病毒科β亚科，基因组大小约230 000 bp，最大编码数超过200多个病毒蛋白，是疱疹病毒科中最大的病毒［1］。约10%感染的新生儿出生后是有症状的，可以留有感音性神经性耳聋、小头畸形、脉络膜视网膜炎、视神经萎缩、肌张力减低和亢进等神经系统相关后遗症［2］。但该病的致病机制仍缺少报道。

本研究通过对位于HCMV UL/b’区的UL145基因编码蛋白互作蛋白的筛选及分析其可能的生物学功能，为研究HCMV UL145编码蛋白在胎儿脑发育中的作用及探讨HCMV感染所致中枢神经系统损伤机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

标本为传代次数<5次的HCMV临床分离株H，取材自就诊于中国医科大学附属盛京医院的HCMV感染患儿。患儿年龄5个月，临床表现包括宫内发育迟缓、直接胆红素升高、转氨酶升高、间质性肺炎和中枢神经系统影像学异常等。从已感染HCMV患儿的尿液中分离出临床分离株H，UL145基因扩增模板采用人胚肺细胞培养的HCMV DNA。

Clontech公司生产的酵母双杂交系统Match⁃maker GAL Two⁃Hybrid System；肖庚富所长（中科院武汉病毒所）惠赠的人胎脑cDNA文库（Matchermak⁃erTM cDNA Libraries）；BECKMAN Allegra系列台式超高速低温离心机；Perkin Elmer Cetus公司PCR循环仪；美国Bio⁃rad MicroPulser电穿孔仪；美国英杰生命技术有限公司完成引物合成及测序。

1.2 方法

1.2.1 构建诱饵表达载体pGBKT7⁃UL145：利用HC⁃MV临床分离株H感染人胚肺细胞，从中提取DNA，用其为UL145基因扩增的模板。设计用于扩增HC⁃MV UL145片段的上下游引物（设计软件采用Oligo 6.0），含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，序列UL145U：CCGGAATTCTTGTCGACCTACGGCGTCCTGGCTCA TTAC，UL145D：CGCGGATCCGGTACCTCAGTTAT CACTTCCACCCATC。选取HCMV DNA为模板，应用实时PCR技术扩增UL145目的基因片段，将获取到的UL145目的片段及载体PGBK⁃T7进行双酶切并切胶回收后纯化，连接纯化好的UL145片段与载体PGBK⁃T7。转化连接后的pGBKT7⁃UL145到大肠杆菌TG1感受态细胞中，菌液进行抗性筛选。采用实时PCR技术鉴定重组克隆，将阳性克隆送至英杰生命技术有限公司，引物选取pGBKT7通用引物进行测序分析。

1.2.2 筛选与HCMV UL145互作的胎脑文库蛋白：（1）对人胎脑cDNA文库进行扩增，采用碱裂解法提取文库质粒，文库酵母表达载体为pACT2（含转录激活域）。（2）应用小剂量醋酸锂酵母转化法转化pGB⁃KT7⁃UL145诱饵表达载体到酵母细胞AH109中，计算转化效率后进行筛选，将提取的文库质粒也转化到酵母细胞AH109中。（3）已转化诱饵质粒及文库质粒计算转化效率并做显色反应筛选显蓝色的阳性单克隆。（4）将阳性单克隆扩增后提取酵母质粒，再将质粒转化到大肠杆菌TG1中，筛选出人胎脑cDNA文库克隆。（5）提取文库克隆质粒并将其回转到含有诱饵载体pGBKT7⁃UL145的酵母AH109中进行验证，涂二缺平板后计算转化效率，涂四缺平板做显色反应。挑选与HCMV⁃UL145相互作用的cDNA文库进行测序，利用GenBank的数据库资源进行比较，对结果进行BLAST分析。

2 结果

2.1 成功构建诱饵表达载体pGBKT7⁃UL145并鉴定

成功扩增出HCMVUL145基因片段，长度大小为393 bp，琼脂糖凝胶电泳显示条带大小与预期一致且无非特异性条带，将已成功连接HCMVUL145目的片段与pGBKT7的诱饵载体命名为pGBKT7⁃UL145。应用PCR技术鉴定（引物选取pGBKT7两端及UL145片段的上下游引物）含pGBKT7⁃UL145质粒的阳性克隆显示结果正确。用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶对提取的pGBKT7⁃UL145质粒进行双酶切鉴定，结果显示可见大小约393 bp及7 500 bp 2条目的条带，送测序分析显示与预期结果一致，见图1。

图1 pGBKT7⁃UL145的成功克隆Fig.1 Cloning of pGBKT7⁃UL145

2.2 文库的筛选及显色反应

转化胎脑cDNA文库质粒到含有诱饵载体pGB⁃KT7⁃UL145的酵母细胞AH109中，菌液涂二缺平板后共长出132个克隆，计算转化效率为4.6×103cfu/μg，符合后续实验要求。在四缺培养基做显色反应有28个菌落呈蓝色，挑取显蓝色的酵母菌落进行扩增，成功提取酵母质粒。

2.3 筛选的酵母质粒回转含UL145基因的酵母菌中

采用电转化法将成功提取的酵母质粒转化到大肠杆菌中，菌液涂含氨苄青霉素的固体培养基，鉴定转化后的文库信息，将选出的7个阳性克隆质粒回转到含诱饵载体pGBKT7⁃UL145的酵母细胞AH109中，菌液涂布于二缺及四缺固体培养基中生长状况。送测序提示与UL145编码蛋白发生相互作用的阳性克隆为7个，运用BLAST分析显示其中3个克隆与FOXG1高度同源，见表1，图2。

3 讨论

图2 转化菌落的PCR鉴定Fig.2 Identification of transformed colonies by PCR

HCMV通过编码蛋白实现对宿主的致病性，同时也决定其毒力的强弱［3］。目前认为HCMV临床株含有19个新基因，位于长独特序列UL与反向重复序列b’区的交界区（UL/b’区），在病毒体内复制、潜伏、免疫逃逸和对宿主的致病性方面起重要作用。而HCMVUL145正是这19个基因之一，具有高度保守性且为细胞核内调节因子直接与DNA相互作用，故UL145对病毒的复制和传播可能起到重要作用［4］。文献报道HCMVUL145基因含有两种转录本结构，它既可以与上游的UL144基因形成多顺反子转录，还可以在感染晚期做为单顺反子转录［5］。临床株HCMV UL145编码蛋白似乎不是分泌型蛋白，它含有蛋白激酶C和酪蛋白激酶磷酸化位点，可以直接与核酸发生相互作用［6］。通过核转染技术将UL129、UL145和UL148传递到ATM缺陷型细胞系胞核内，观察其对基因组入核的影响，结果显示UL129和UL145基因产物的过表达可能对细胞具有毒性［7］。

表1 阳性克隆与GeneBank同源序列比较Tab.1 Comparison of positive clones with samples available in GenBank and percent homology

本研究结果显示HCMVUL145基因编码产物与转录因子FOXG相互作用。FOXG1属于Fork⁃head转录因子基因家族，进化上高度保守，细胞内定位受翻译后控制，在胞质和胞核交替出现，具有转录活化和转录抑制双重作用。FOXG1基因定位于人类最大的染色体—14号染色体上，1条或者2条同源染色体的FOXG1基因发生易位、缺失、突变等情况均导致神经系统疾病。FOXG1基因广泛表达于大脑皮层，转录因子诱导FOXG1蛋白表达剂量不足［8］，可造成中枢神经系统发育障碍，表现为人脑体积缩小及形态异常，引起癫痫及智力低下。研究［9］表明FOXG1单倍剂量不足导致小鼠和人视皮质功能损伤。部分重要的神经系统疾病中发现FOXG1基因存在突变或失常，包括存在神经系统发育异常的瑞氏综合征，其伴有早期癫痫和先天症状的多样性和FOXG1基因的突变相关［10］。在孤独症谱系障碍疾病中，过多的GABA能神经元造成了体内谷氨酸/GABA神经元比率的失衡，被认为参与了孤独症谱系障碍疾病的发病过程中，而转录因子FOXG1过表达正是GABA能神经元产量过多的原因［11］。FOXG1的亚细胞定位可能在细胞分化、复制和生物能量转化中起到重要作用，并将线粒体功能与胚胎发育和病理状态相联系起来［12］。

本研究推测HCMV入侵人体后UL145编码蛋白通过改变其自身细胞定位，对正常细胞分化、复制产生影响，提示FOXG1在巨细胞病毒感染引起的中枢神经系统损伤也可能与此相关，其具体机制有待更深层次的功能性研究。未来的研究计划是采用免疫共沉淀及pull down技术阐明HCMV UL145编码蛋白与FOXG1之间的关系，为解释本病的致病机理奠定分子基础。

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（编辑 于溪）

Screening and Analysis of Proteins Interacting with HCMV UL145 from a Human Fetal Brain cDNA Library

ZOU Fei1，2，WANG Shuang1，WU Si1，SUN Zhengrong1
（1.BioBank，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Pediatrics，The First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China）

ObjectiveTo screen a human fetal brain cDNA library for proteins that can interact with HCMV UL145 using a yeast two⁃hybrid sys⁃tem.MethodsA bait plasmid（pGBKT7⁃UL145）was constructed.Using HCMVUL145as bait，a human fetal brain cDNA library was screened and proteins interacting withUL145were identified using bioinformatic methods to sequence and analyze the positive clones.ResultsThree clones interacting with HCMV UL145 were found，and identified as FOXG1.ConclusionSeveral proteins interacting with HCMV UL145 in the human fetal brain cDNA library were identified as FOXG1，indicating that this protein may play an important role in the course of HCMV infection.

human cytomegalovirus；UL145 protein；yeast two⁃hybrid system；human fetus brain cDNA library

R373

A

0258-4646（2017）04-0309-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.04.006

国家自然科学基金（81171581）

邹飞（1983-），女，主治医师，硕士.

孙峥嵘，E-mail：sunzr@sj⁃hospital.org

2016-10-12

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