ESRP1在直肠癌细胞上皮间质转化中的作用

劳玲娟，宋新江

（绍兴第二医院，浙江 绍兴312000）

ESRP1在直肠癌细胞上皮间质转化中的作用

劳玲娟，宋新江

（绍兴第二医院，浙江 绍兴312000）

目的 分析上皮剪接调节蛋白1（ESRP1）在直肠癌组织及细胞系中的相对表达水平，以及ESRP1对直肠癌细胞上皮间质转化（EMT）中的作用及其机制。 方法 采用Western blot检测ESRP1在42例直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达水平；利用Western blot检测ESRP1在直肠癌细胞及人正常结肠上皮细胞中的表达；将ESRP1 mimic或mimic NC瞬时转染SW 480细胞后，Transwell实验检测细胞侵袭；Western blot法检测瞬转ESRP1mimic后对ESRP1、E-cadherin、N-cadherin、Snail和Twist蛋白表达的影响。 结果 与癌旁正常组织相比，ESRP1在直肠癌组织中的相对表达水平明显下调（P＜0.01），ESRP1的表达与直肠癌的淋巴结转移相关；与NCM460细胞相比较，ESRP1在直肠癌细胞株中的表达量均显著下调 （P＜0.01）；ESRP1mimic转染SW480细胞后可抑制SW480细胞侵袭，同时上调E-cadherin的表达，并下调N-cadherin、Snail和Twist蛋白在SW480细胞内的表达。 结论 ESRP1在直肠癌组织和细胞系中的表达均显著下调，ESRP1与直肠癌细胞EMT明显相关。

直肠癌；上皮剪接调节蛋白1；上皮间质转化

恶性肿瘤的主要特征是侵袭和转移。肿瘤转移是一个复杂、多因素的级联反应过程，而肿瘤细胞上皮-间质转化的动态转换是肿瘤细胞转移过程中非常重要的步骤[1-2]。上皮剪接调节蛋白1（Epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1）作为一种定位于细胞核内的蛋白，其可通过直接结合特异性mRNAs序列，调节细胞增殖、凋亡和侵袭等相关基因的表达，使其蛋白表达水平发生转变，从而在调节恶性肿瘤的多种恶性生物学行为中发挥重要作用[3]。但ESRP1在直肠癌中的表达和作用尚不明确，本文研究分析了ESRP1在直肠癌组织和体外细胞中的表达，同时进一步研究其对体外直肠癌细胞 上 皮 间 质 转 化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集2012年8月～2016年8月在本院肛肠外科经手术切除的42例新鲜直肠癌组织及其癌旁正常组织标本，其中男28例，女14例，年龄43～75岁，平均（58.6±4.3）岁。所有病例经病理确诊为直肠腺癌，且未接受过新辅助治疗。排除有以下症状或者诊断的病例：下咽困难、急慢性感染、充血性心力衰竭、COPD和肝硬化。

1.1.2 试剂 Opti-MEM培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol试剂和Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒和细胞蛋白提取试剂盒购自日本TaKaRa株式会社；ESRP1 mimic及mimic阴性对照（mimic NC）购自锐博生物；ECMatrix胶和Transwell小室购自美国BD公司；ESRP1、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Twist和β-action抗体购自美国Epitomics公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胚肾细胞株HEK-293T、人直肠癌高分化腺癌细胞株Caco-2、人直肠癌低分化腺癌细胞株SW480及人正常结肠上皮细胞株NCM460均由上海细胞生物研究所提供。细胞培养于DMEM培养基中，培养基中补充10%胎牛血清、青霉素（100U/μL）和链霉素（100μg/mL）。细胞培养在37℃且CO2含量约为5%的细胞培养箱内进行。当细胞生长至占培养瓶底面积90%以上时用胰蛋白酶消化并用于实验。

1.2.2 ESRP1的表达 所有标本均使用4%的多聚甲醛固定、梯度浓度乙醇脱水、石蜡包埋及切片后，按照SP染色法进行免疫组化染色，使用PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组化：烘片、脱蜡与水化、封闭、加一抗、加二抗、DAB显色、镜检。ESRP1染色阳性表达于细胞浆内，在低倍镜下随机选择10个视野并拍照，后期使用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件分析ESRP1在标本中的阳性表达情况。

1.2.3 ESRP1mimic及mimic NC转染至SW480细胞 将对数生长期的SW480细胞接种于24孔板中，每孔2×105个细胞，将5μL浓度为20μmol/L的ESRP1 mimic与5μL转染试剂Lipofectamine2000混匀后加入细胞中，ESRP1mimic的转染终浓度为100nmol/L，将培养板置于细胞培养箱中孵育48小时后进行相关功能性、qRT-PCR和Western blot等检测。mimic NC的转染方法同ESRP1mimic的转染。

1.2.4 细胞体外侵袭实验 收集对数生长期SW480细胞，加入无血清培养基中，调整细胞浓度为1×104/mL，将300μL细胞悬液和300μL含20%胎牛血清的培养基分别加入Transwell上室和下室，放置细胞培养箱中培养24小时后加入结晶紫染色液染色20分钟，在倒置显微镜下观察穿过小室的蓝染细胞，在高倍镜下随机计数10个视野，计算平均值，每组重复3次。

1.2.5 体外细胞中ESRP1蛋白的表达 Western blot检测体外细胞中ESRP1蛋白的表达。SW480细胞在冰冷的PBS液中洗涤3次后重悬于细胞裂解液（100μL/孔）中。当细胞裂片置于冰上反应30分钟，再在4°C下12000×g离心20分钟，收集上清后使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白质浓度进行定量分析。蛋白质样品（30μg）使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至0.45μm硝酸纤维素膜上，并使用5%脱脂奶粉于4℃下孵育过夜，该膜在4°C与一抗在室温下反应30分钟后，在室温下与二抗再次孵育1小时。以内参β-actin蛋白条带灰度值的比值来校正母蛋白的光密度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件包，计量数据均以（±s）表示，使用t检验和方差分析对所得样本数据进行统计学分析。

2 结果

2.1 ESRP1在直肠癌组织中的表达 Western blot检测结果表明，ESRP1在直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达分别为（3.258±0.56）和（11.254±1.89），两组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图1A）；42例直肠癌组织标本中，ESRP1在淋巴结转移患者中的表达显著低于未发生淋巴结转移者，差异具有统计学意义（P＜0.05）；但直肠癌组织中ESRP1的表达水平与患者性别、年龄、分化程度和肿瘤浸润深度无明显相关性 （表1）；免疫组化检测，ESRP1蛋白在25例淋巴结转移阳性直肠癌标本中较17例淋巴结转移阴性直肠癌标本中明显下降（图1B）。

图1 Western blot检测ESRP1在人直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达（1A）；免疫组化检测ESRP1在淋巴结转移阳性及淋巴结转移阴性直肠癌标本中的表达（1B）。

表1 42例直肠癌中ESRP1与临床病理因素的关系

2.2 ESRP1对体外直肠癌细胞侵袭的影响 如图2A所示，Western blot实验检测结果表明，ESRP1在人正常结肠上皮细胞系NCM460、人直肠癌细胞系Caco-2和SW480中的表达分别为（6.34±1.04）、（3.15±0.48） 和 （1.05±0.21）， 表明 ESRP1在NCM460细胞中的表达较Caco-2和SW480细胞明显升高，差异有统计学意义 （P＜0.01）；同时ESRP1在SW480细胞中的表达较Caco-2细胞明显降低（P＜0.01），后续实验选择SW480细胞作为实验对象，分别将ESRP1 mimic或mimic NC转染入SW480细胞48小时后，利用Western blot检测SW480细胞中的转染情况，ESRP1在对照组、mimic NC组和ESRP1 mimic组中的表达分别为（2.57±0.24）、（2.38±0.34）和 （9.64±1.27），表明ESRP1 mimic可明显上调ESRP1蛋白在SW480细胞中的表达，差异有统计学意义（P＜0.01），而转染mimic NC对ESRP1的相对表达量无明显影响（图3）。细胞侵袭实验表明，SW480细胞经转染ESRP1 mimic后可显著抑制细胞侵袭行为 （图2C），对照组、mimic NC组和 ESRP1 mimic组侵袭出ECMatrix胶的细胞数分别为 （54.4±10.5）、（65.2± 14.9）和（8.8±1.7）个，mimic NC组与ESRP1 mimic组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图2 Western blot检测ESRP1在NCM460、Caco-2和SW480细胞系中的表达 （2A）；转染ESRP1mimic或mimic NC至SW480细胞后对ESRP1表达的影响（2B）。

图3 倒置显微镜下观察分别转染ESRP1mimic或mimic NC后对SW480细胞侵袭行为的影响（×200）

2.3 ESRP1对 E-cadherin、N-cadherin、Snail和Twist表达的影响 Western blot检测结果表明，转染 mimic NC对 SW480细胞中 E-cadherin、N-cadherin、Snail和Twist蛋白的表达无明显影响，但转染ESRP1 mimic可明显上调E-cadherin蛋白在SW480细胞中的表达，同时抑制N-cadherin、Snail和Twist蛋白的表达 （图4），与mimic NC组相比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），各组目的蛋白吸光度分析见表2。

图4 Western blot检测转染ESRP1 mimic或mimic NC后对SW480细胞中E-cadherin、N-cadherin、Snail和Twist蛋白的影响（以β-actin为内参）

表2 三组E-cadherin、N-cadherin、Snail和Twist蛋白表达的灰度值比较

3 讨论

Yae等[4]发现ESRP1在结肠上皮细胞中的异常表达可上调E-cadherin的表达，增强细胞的粘附性，从而抑制结肠上皮细胞的成瘤性。近期研究发现，ESRP1在胰腺癌组织中表达较正常胰腺组织中表达明显下调，同时ESRP1的表达与肿瘤分化程度明显相关[5]，但其作用机制尚不明确。本文显示，ESRP1在直肠癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织，提示ESRP1在直肠癌发生的早期阶段可能有抑癌作用；同时，ESRP1在有淋巴结转移直肠癌组织中的表达水平较无淋巴结转移直肠癌组织明显降低，提示ESRP1在直肠癌的转移阶段也起到了抑癌的作用，同时ESRP1在体外直肠癌细胞株中的表达也低于正常结肠上皮细胞中的表达，这种ESRP1在良恶性组织及细胞中的表达差异表明ESRP1与直肠癌细胞的发生和转移可能存在一定的关联。

在特定生理和病理情况下，上皮细胞暂时丧失极性并表现出具有移行能力的间质细胞的现象称为EMT。目前尚未有ESRP1与直肠癌细胞EMT的相关报道。作者通过ESRP1mimic上调SW480细胞中ESRP1的表达，发现上调ESRP1对体外SW480细胞侵袭性行为有明显的抑制作用，表明ESRP1与直肠癌转移密切相关。

目前证实多种转录因子，如cadherin、Twist、Snail、Slug和ZEB-1等，参与对上皮间质可塑性变化的表面关键分子标记的调控。钙黏蛋白（cadherin）作为一类上皮组织中介导细胞间连接的钙依赖性跨膜糖蛋白，在维持组织细胞结构完整性和极性中发挥着重要作用，E-cadherin可维持上皮细胞特性，而N-cadherin是维持间质细胞特征的重要分子，E-cadherin向N-cadherin的转化在多种恶性肿瘤中被认为是肿瘤EMT程度和恶性程度的标志[6-8]。目前已有多项研究证实包括Twist和Snail在内的转录因子在多种恶性肿瘤中过度表达，Twist和Snail不仅调控机体早期胚胎发育过程，而且对EMT表面关键分子标记的表达也有一定调节作用。其中Twist可诱导EMT介导的循环肿瘤细胞的形成和定植，从而在肿瘤恶性转化和转移等多种恶性生物学行为中发挥着重要作用[9-10]。在EMT过程中其转录因子Twist、Slug和Snail被活化，诱导EMT过程中Vimentin、N-cadherin表达上调，同时抑制E-cadherin表达[11]。在本研究中，上调ESRP1在体外直肠癌细胞中的表达可明显上调E-cadherin的表达，同时抑制 N-cadherin、Twist和Snail的表达，表明ESRP1可能通过调控EMT相关因子的表达，从而对直肠癌细胞转移产生一定的影响。

综上所述，本研究表明ESRP1与直肠癌转移明显相关，但ESRP1是否对体内直肠癌同样具有抑制转移作用尚不明确，同时虽然证实ESRP1可抑制体外直肠癌细胞EMT，但ESRP1与EMT之间是直接还是间接调控仍需进一步研究，为临床直肠癌基因治疗提供新的靶点。

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[4] Yae T，Tsuchihashi K，Ishimoto T，et al.Alternative splicing of CD44 mRNA by ESRP1 enhances lung colonization of metastatic cancer cell.Nat Commun，2012，6（3）:883

[5] Horiguchi K，Sakamoto K，Koinuma D，et al.TGF-βdrives epithelial-mesenchymal transition throughδEF1-mediated downregulation of ESRP.Oncogene，2012，31（26）:3190

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