RACK-1和Twist在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

李雪莲，毛熙光，张蓓

（1.西南医科大学 临床医学院，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属医院，四川泸州 646000；3.江苏省徐州市中心医院，江苏 徐州 221009）

RACK-1和Twist在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

李雪莲1，毛熙光2，张蓓3

（1.西南医科大学 临床医学院，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属医院，四川泸州 646000；3.江苏省徐州市中心医院，江苏 徐州 221009）

目的探讨RACK-1和Twist在宫颈癌中的表达及其临床意义。方法选取2006年5月-2010年6月在该医院手术治疗的宫颈癌患者70例，选取同期因宫颈良性病变行肿物剥除或附件切除的20例患者作为对照，采用免疫组织化学SP法检测70例宫颈癌组织（宫颈癌组）、70例宫颈癌癌旁组织（癌旁组）、20例正常宫颈组织（正常组）中Twist和RACK-1蛋白的表达，分析其与宫颈癌患者临床病理特征的关系。结果①正常组、癌旁组、宫颈癌组的Twist阳性率分别为5.0%（1/20）、22.9%（16/70）和95.7%（67/70），差异有统计学意义（P＜0.05）；正常组、癌旁组、宫颈癌组的RACK-1阳性率分别为10.0%（2/20）、61.0%（43/70）和90.0%（63/70），差异有统计学意义（P＜0.05）。②Twist表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关（P＜0.05）。RACK-1表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关（P＜0.05）。③Twist与RACK-1呈正相关（P＜0.05）。④Twist高表达者和低表达者的5年总生存率分别为51.2%和29.2%[HR=11.637（95%CI：4.351，38.213）P=0.002]；RACK-1高表达者和低表达者的5年总生存率分别为41.3%和35.3%[HR=10.143（95%CI：4.285，33.275）P=0.006]。结论Twist和RACK-1的表达升高与宫颈癌侵袭性增强关系密切，其表达水平可判断宫颈癌患者的预后。

宫颈肿瘤；Twist；RACK-1；肿瘤浸润

宫颈癌占我国女性生殖系统恶性肿瘤第1位，确诊时多为晚期，预后较差，5年生存率仅为60%，有远处转移患者的生存率更低。近年来，虽然手术治疗及放、化疗方案均有改进，患者的5年生存率有所改善，但远期生存率仍不能令人满意。因此，针对肿瘤的增殖和侵袭性进行基因治疗非常有意义[1]。最新研究认为，Twist是一种癌基因，与肿瘤细胞的凋亡关系密切，参与上皮细胞问质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT），参与肿瘤的侵袭、转移[2]。RACK-1是新近发现的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）受体蛋白，在生物学反应，如细胞生长分化转移侵袭方面，发挥关键的调节作用[3]。本实验采用免疫组织化学法检测Twist和RACK-1蛋白在宫颈癌组织中的表达，探讨两者表达的相关性，以及表达强弱与宫颈癌患者预后的关系，旨在了解宫颈癌可能的发病机制，探索预测宫颈癌预后新的肿瘤指标，并为宫颈癌的基因靶向治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2006年5月-2010年6月在西南医科大学附属医院妇产科首次采取经腹宫颈癌根治手术治疗的70例宫颈癌患者为研究对象。纳入标准：①所有患者经组织病理学检查，明确宫颈癌诊断；②临床病历资料完整；③患者术前未接受任何放、化疗；④无心、脑、肝、肾等其他器官障碍。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②随访资料不完整或失访。纳入患者年龄22～74岁，平均（42.6±13.2）岁；宫颈鳞状细胞癌59例，腺癌11例；按国际妇产科联盟分期标准：Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ、Ⅳ期42例；病理分化程度：高分化8例，中分化25例，低分化37例；有淋巴结转移47例，无淋巴结转移23例。本研究中所有患者签署知情同意书，并经本院伦理道德委员会同意。

1.2 方法

1.2.1 分组及随访将70例患者手术切除的宫颈癌组织作为宫颈癌组；70例患者取癌组织旁组织2 cm作为癌旁组；另取同期在本院因宫颈良性肿瘤等行宫颈肿物剥除或附件切除术获取的20例正常宫颈组织作为正常组。对70例宫颈癌患者进行随访，随访截至时间为2015年7月1日，平均随访时间52.1个月。

1.2.2 Twist和RACK-1蛋白的检测将收集的宫颈癌组织、癌旁组织及正常宫颈组织标本进行石蜡包埋切片，并采用免疫组织化学SP法检测组织中Twist和RACK-1蛋白的表达。采用兔抗人Twist和RACK-1单克隆抗体（英国Abcam公司），工作浓度为分别为1∶150和1∶100；由同一病理科人员严格按照免疫组织化学SP法试剂盒（北京中杉桥生物公司）说明书进行操作，用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知抗体阳性标本作为阳性对照。

1.2.3 阳性表达的强度判定阳性表达的强度判定：①每张切片选取连续10个高倍视野（×400），每个视野计数200个细胞，分别计数其中的所有阳性染色细胞，计算阳性细胞率，根据阳性细胞率评分，0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分；②根据细胞染色强度评分，细胞未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将上述2种评分结果相乘，即为综合评分，用于判定阳性表达强度，综合评分0～1分为阴性，2～5分为弱阳性（+），6～8分为阳性（++），9分为强阳性（+++）。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，非正态分布的计量资料比较，采用Log-rank检验；计数资料以率（%）表示，用χ2检验或Fisher确切概率法；Twist与RACK-1蛋白的相关性分析用Pearson相关分析；采用Kaplan-Meier生存曲线计算5年生存率和中位生存时间，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者Twist、RACK-1阳性表达率比较

Twist蛋白阳性染色呈棕色细小颗粒，均位于细胞质；RACK-1蛋白阳性染色呈棕黄色或棕褐色颗粒，分布于细胞核和细胞质内。

Twist和RACK-1蛋白主要位于细胞质，正常组表达阴性，癌旁组呈淡黄色或黄色阳性表达，宫颈癌组呈棕褐色强阳性表达。3组患者Twist和RACK-1阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。宫颈癌组与癌旁组的Twist、RACK-1阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=19.351和10.068，P=0.000和0.010）；宫颈癌组与正常组的Twist、RACK-1阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=32.074和19.169，均P=0.000）；癌旁组与正常组的Twist、RACK-1阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=15.216和17.611，P=0.010和0.000）。宫颈癌组、癌旁组及正常组的Twist、RACK-1阳性表达率依次减弱。见表1和图1。

2.2 不同临床病理特征的Twist、RACK-1阳性表达率比较

2.2.1 Twist宫颈癌肿瘤浸润深度为T3、T4患者的Twist阳性表达率与T1、T2患者比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。宫颈癌伴有淋巴结转移患者的Twist阳性表达率与不伴淋巴结转移患者比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。Twist在宫颈癌肿瘤患者年龄（＜55岁或≥55岁）、病理类型（局限型或浸润型）、分化程度（低或高、中分化）及TNM分期（Ⅰ、Ⅱ期或Ⅲ、Ⅳ期）的阳性表达率比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2.2 RACK-1宫颈癌低分化患者的RACK-1阳性表达率与高、中分化患者比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。宫颈癌肿瘤浸润深度为T3、 T4患者的RACK-1阳性表达率与T1、T2患者比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。宫颈癌伴有淋巴结转移患者的RACK-1阳性表达率与不伴淋巴结转移患者比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。肿瘤TNM分期Ⅲ、Ⅳ期患者的RACK-1阳性表达率与Ⅰ、Ⅱ期患者比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。RACK-1在宫颈癌肿瘤患者年龄（＜55岁或≥55岁）、病理类型（局限型或浸润型）的阳性表达率比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 Twist与RACK-1蛋白表达的相关性分析

本组70例宫颈癌组织中，Twist和RACK-1蛋白同时表达阳性为67.1%（47/70），同时表达阴性为21.4%（15/70），两者在宫颈癌组织中的表达呈正相关（r=0.271，P=0.012）。

2.4 Twist和RACK-1蛋白不同阳性表达强度患者的生存分析

本组70例宫颈癌患者均电话或门诊随访，66例完成随访，1例Twist蛋白表达阳性患者失访，3例RACK-1蛋白表达阳性患者失访，失访率为5.7%（4/70），失访人群按截尾数据处理。66例完成随访的宫颈癌患者中，51.5%（34/66）死亡，48.5%（32/66）存活，66例患者5年生存率为39.3%，中位生存时间36.9个月。Twist和RACK-1蛋白强阳性表达者的5年生存率及中位生存时间与弱阳性和阳性表达者比较，经Log-rank检验，差异有统计学意义（P＜0.05），Twist、RACK-1蛋白强阳性表达者的5年生存率和中位生存时间低于Twist、RACK-1弱阳性和阳性表达者。影响宫颈癌患者5年生存结局的危险因素包括Twist和RACK-1蛋白强阳性表达（P＜0.05）。见表3。

表1 3组患者Twist、RACK-1阳性表达率比较

表2 不同临床病理特征的Twist和RACK-1阳性表达率比较

表3 Twist和RACK-1蛋白不同阳性表达强度患者的生存分析

3 讨论

3.1 Twist蛋白表达与宫颈癌的关系

Twist是最近发现的一种细胞因子，参与肿瘤的浸润、转移，但关于Twist的确切机制尚不清楚[4]。近年来大量研究提示，Twist与胃癌、结直肠癌、卵巢癌的侵袭、远处转移及预后密切相关[5-9]。但Twist在宫颈癌中的作用鲜见报道，其作用机制尚不明确。2008年，SHIBATA等[10]对100多例子宫颈癌组织检测Twist蛋白的表达情况，并进行生存分析，结果提示Twist是预测子宫颈癌患者预后差的独立因素。LI等[11]对142例子宫颈组织中Twist 2表达情况进行检测，结果发现，其在宫颈上皮样瘤变和鳞状宫颈癌组织中高表达，提示Twist 2与子宫颈癌发展密切相关，可以作为预测子宫颈恶性转化及转移的预后因素。李旻等[12]研究表明，Twist蛋白在宫颈癌组织高表达，可以预测子宫颈癌的恶性转化和转移。本研究采用免疫组织化学法检测Twist蛋白在宫颈正常组织、宫颈癌组织中的表达，结果显示，Twist蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达率较癌旁组织或正常组织高；Twist蛋白在正常宫颈组织中基本不表达，而在宫颈癌组织中高表达；肿瘤浸润度高和有淋巴结转移的宫颈癌患者的宫颈组织中，Twist蛋白阳性表达率更高；Twist蛋白强阳性表达是影响宫颈癌患者5年生存结局的危险因素，该类患者5年生存率更低，中位生存时间更短，提示Twist过表达可能与宫颈癌发生、发展有关。

3.2 RACK-1蛋白表达与宫颈癌的关系

RACK-1基因首次于1991年在鸡的cDNA中发现，主要位于人类染色体5q35.3[13]。RACK-1蛋白可与细胞内多种信号分子结合，调节细胞的生长、分化及迁徙，细胞之间异常的信号传导。目前关于RACK-1基因调控细胞浸润的机制尚不清楚。有学者提出RACK-1可能激活Akt信号通路，进而调节细胞周期相关蛋白的表达[14]。国外其他学者则认为，RACKI通过PKC信号通路，调节肿瘤组织中新生血管的形成，参与肿瘤的发生、发展[15]。

大量研究证实，RACK-1蛋白在多种肿瘤组织高表达。RACK-1在口腔鳞癌组织中高表达，在口腔癌前病变组织中表达也显著增加，且表达水平与患者的预后呈负相关，可作为口腔鳞癌预后的标志物之一[16]。RACK-1蛋白在乳腺癌中高表达，且表达水平与肿瘤的浸润、转移等病理因素有关，是肿瘤预后的独立危险因子[17]。但关于RACK-1蛋白在宫颈癌表达的研究不多，未来可能是一个治疗宫颈癌的靶点。为明确RACK-1蛋白与宫颈癌的关系，本研究观察RACK-1在宫颈组织中的表达及其与预后的关系。结果表明，随着恶性程度的增加，RACK-1蛋白的表达率逐渐升高；同时研究发现，RACK-1与分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关。这提示RACK-1与宫颈癌的远处转移、浸润有关，可作为宫颈癌发生、发展及转移的预测因子。

3.3 Twist和RACK-1蛋白共同高表达在宫颈癌中的意义

在癌细胞浸润、转移过程中，RACK-1发挥至关重要的作用。有研究表明，在乳腺癌细胞浸润、转移过程中，RACK-1可能与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的活化、纤维蛋白溶酶激活有关，其可激活MMP-2、MMP-9，溶解细胞外基质，最终引起癌细胞的浸润、远处转移[18]。Twist促进肿瘤细胞转移的机制与其能够使细胞失去上皮性标志物，如E-钙黏蛋白，而获得间质细胞的标志物，如波形蛋白和平滑肌肌动蛋白等有关[19]。本研究显示，Twist与RACK-1蛋白表达呈正相关。这表明其在宫颈癌进展中可能发挥协同作用。联合检测Twist和RACK-1蛋白可协助判断宫颈癌的预后，有望成为新的宫颈癌指标。

3.4 Twist和RACK-1蛋白表达与宫颈癌患者预后的关系

张一鸣等[20]研究表明，Twist在宫颈癌组织和血浆中高表达，且与宫颈癌的复发密切相关。鲍伟等[21]研究提示，Twist高表达与5年无瘤生存时间、总生存时间相关；多因素Cox风险回归分析显示，宫颈癌患者Twist高表达是一个独立预后因素。杨丹丹等[22]研究发现，RACK1高表达与子宫颈癌的恶性程度、浸润转移呈正相关，患者的生存率更低。本研究结果显示，Twist和RACK-1蛋白强阳性表达患者与弱阳性和阳性表达患者的死亡风险的有差异；Twist、RACK-1蛋白强阳性表达者的5年生存率和中位生存时间较弱阳性和阳性表达者低。因此推测，Twist和RACK-1蛋白的高表达可能反映宫颈癌患者的不良预后。

综上所述，Twist和RACK-1蛋白都可能成为宫颈癌新的肿瘤标志物，两者联合检测可能更有价值。两者在宫颈癌的进展过程中具有协同作用，但其作用机制尚需要进一步探讨，阻断两者信号传导通路有可能成为抑制宫颈癌的新方法。

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Expressions of Twist and RACK-1 in cervical carcinoma and clinical significance

Xue-lian Li1, Xi-guang Mao2, Bei Zhang3
(1. Clinical College of Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan 646000, China; 2. The Aff i liated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan 646000, China; 3.department of Obstetrics
and Gynecology, Xuzhou Central Hospital, Xuzhou, Jiangsu 221009, China)

ObjectiveTo study Twist and RACK-1 expressions in cervical carcinoma, and analyze the clinical significance.MethodsThis study enrolled the cervical carcinoma tissues (cervical carcinoma group) and para-cancerous tissues (para-carcinoma group) of 70 patients with cervical carcinoma and the normal cervical tissues (control group) of 20 patients with benign cervical tumor from May 2006 to June 2010 in the Affiliated Hospital of Southwest Medical University. Twist and RACK-1 expressions in the three groups weredetected with immunohistochemical SP method. Their correlations with clinicopathological parameters of cervical carcinoma were analyzed.ResultsThe positive expression rates of Twist in the control group, the para-carcinoma group and the cervical carcinoma group were 5.0% (1/20), 22.9% (16/70) and 95.7% (67/70) respectively, with significant differences among them (P＜ 0.05). The positive expression rates of RACK-1 in the control, para-carcinoma and cervical carcinoma groups were 10.0% (2/20), 61.0% (43/70) and 90.0% (63/70) respectively, with significant differences among them (P＜ 0.05). The expression of Twist was correlated with TNM stage,degree of tumor differentiation and lymph node metastasis (P＜ 0.05). The expression of RACK-1 was correlated with TNM stage,degree of tumor differentiation,depth of invasion and lymph node metastasis (P＜ 0.05). There was a positive correlation between Twist and RACK-1 (P＜ 0.05). The 5-year overall survival rates for the patients with high Twist expression (+++) and low expression (+, ++) were 51.2% and 29.2% [HR = 11.637 (95% CI: 4.351, 38.213),P= 0.002]. The 5-year overall survival rates of the patients with high RACK-1 expression (+++) and low expression (+, ++) were 41.3%and 35.3% [HR = 10.143 (95% CI: 4.285, 33.275),P= 0.006].ConclusionsThe up-regulated expressions of Twist and RACK-1 are closely related to the increased malignancy and invasion of cervical carcinomas. The expressions of Twist and RACK-1 might be used as indicators for prediction of the prognosis of patients with cervical carcinomas.

cervical neoplasms; Twist; RACK-1; neoplasm invasiveness

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.02.009

1005-8982（2018）02-0047-06

R737.33

A

2016-10-04

毛熙光，E-mail：MXG6639@163.com

（童颖丹 编辑）