环状RNA 与自身免疫性疾病

郑凤屏，戴 勇

作者单位:518020深圳，深圳市人民医院暨南大学第二临床医学院肾内科

众所周知，真核基因经剪接后会产生成熟信使RNA(messenger RNA，mRNA)和多种mRNA亚型［1］，而环状 RNA(circular RNA，circRNA) 是非规范选择性剪接所产生的，将剪接供体连接到上游剪接受体而形成的无5'至3'极性、5'帽化和3'聚腺苷酸化的共价闭合环［2-3］。共价闭合环结构使Circ-RNA具有RNase R抗性，且半衰期超过48 h。根据circRNA所包含的序列，circRNA可以分为3种，即外显子circRNA、内含子cricRNA和含有外显子和内含子序列的circRNA。最近的研究表明，在人和果蝇中，数百个circRNA比它们相应的线性转录产物表达水平更高［4］。上述发现冲击了长期以来的想法，即circRNA是拼接错误的副产物［5-8］。到目前为止，尽管大多数circRNA的作用是未知的，但有报道显示circRNA具有miRNA海绵作用和调节基因转录的功能［9-10］，由于miRNA在自身免疫性疾病中的重要性以及circRNA可作为miRNA海绵的作用，推测在circRNA和自身免疫性疾病之间可能存在特定的联系，circRNA可能是未来自身免疫性疾病的治疗靶点。本文对circRNA的识别、功能及其与人类疾病的关系进行综述，探索circRNA在自身免疫性疾病的潜在作用。

1 CircRNA的识别

随着生化富集策略、计算方法和深度测序的出现，大量的circRNA在古生菌、果蝇和人类中被发现［11-12］。例如在用核糖体RNA耗竭和RNase R消化处理的人成纤维细胞系中，通过MapSplice［13］的作图鉴定了大约25 000个来源于约15%转录基因的circRNA。然而，以下几个问题对circRNA的研究带来巨大挑战，如TopHat融合、MapSplice、find_circ、segemehl和CIRI这5种方法对circRNA的检测发现circRNA表现出不同的灵敏度和精度，不同的RNA文库处理和严格的参数水平发现circRNA的全基因组鉴定也可能存在偏倚。因此需要寻找适当的方法来鉴别具有转拼、遗传重排、逆转录酶模板转换和串联重复的circRNA［14］。

2 CircRNA作为miRNA的海绵

对于circRNA的功能，研究最为深入且最为明确研究的是小脑变性相关蛋白酶1(cerebellar degeneration-related protease 1，CDR1as)(又称ciRS-7)可作为miR-7海绵的作用。人类CDR1拥有74个miR-7匹配位点，并密切结合Argonaute(Argonaute，AGO)蛋白家族，即一种miRNA效应蛋白［15］。MiR-671以AGO2依赖性方式指导CDR1as的切割［16］。小脑变性相关蛋白1(cerebellar degeneration-related protine 1，CDR1)主要位于细胞质中，在脑组织中与miR-7呈高度共表达，且在脑组织中也观察到了由miR-7、AGO2和CDR1as组成的三元复合物，这些结果提示CDR1as具有海绵功能。CDR1能有效减少miR-7引起的敲除CDR1as基因的可能性，HEK293细胞中敲除CDR1as基因可抑制miR-7功能。此外，在Hela-CDR1as细胞中miR-671的高表达也可拮抗CDR1as对miR-7靶基因的作用。将CDR1as导入到斑马鱼胚胎中可逆转由miR-7敲除引起的中脑体积的减小，且miR-7前体也可部分地挽救中脑体积的缩小。另一个具有miRNA海绵作用的circRNA是环状Sry［9］。目前在环状Sry中已识别出了16个miR-138靶位点，在环状Sry存在的情况下，miR-138的敲除效率显著降低。环状Sry的海绵效应不如CDR1as明显，其原因可能是环状Sry含量较少以及miR-138靶位点较少。值得注意的是，与人类同源性很高的小鼠Sry仅有一个miR-138靶位点。锌指蛋白91(zinc finger protein 91，ZNF91)产生的circRNA有24个miR-23位点和39个miR-296位点，说明circRNA具有螯合这些miRNA的作用［17］，此外还发现circRNA中miRNA靶位点的SNP降低［18］，这些研究均说明circRNA具有miRNA海绵作用。目前已证实miRNA与多种疾病相关，因此推测作为miRNA海绵的circRNA与相关疾病可能也有关联。

3 circRNA与人类疾病

3.1 circRNA与癌症

相关的研究已逐渐揭示出circRNA与癌症之间的关系。与正常结肠样本相比，结肠肿瘤组织中环状与线性RNA的总丰度和比例降低，并与增殖指数呈负相关［19］。食管鳞状细胞癌和结肠直肠癌中的Cir-ITCH表达低于肿瘤周围组织。Cir-ITCH可能通过抑制Wnt/β-catenin途径从而增加ITCH的表达，Cir-ITCH在两种癌症中的畸变可通过有缺陷的Wnt信号传导促进这些病症的发展［16，20］。考虑到circRNA的稳定性，目前的研究主要集中于其是否具有作为肿瘤诊断和病理特征的生物标志物的潜力方面。例如，研究表明胃癌组织中Has_circ_002059的表达明显少于非肿瘤组织，而has_circ_002059的低表达与肿瘤快速远端转移和肿瘤-转移瘤的阶段明显相关［21］。Has_circ_0001649在肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)组织中的表达量明显低于相邻肝组织，其表达量与HCC肿瘤大小和肿瘤栓塞的发生有关。此外，肝癌细胞系中的has_circ_0001649减少可增强基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMP)活性，从而利于HCC转移［22］。目前发现circRNA在胰腺导管腺癌 (pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中的表达也出现异常［23］。改变内含子-外显子序列方法构建的针对miR-21和miR-221的circRNA海绵在抑制细胞增殖和迁移及促进人黑素瘤细胞系的凋亡方面较线性miRNA海绵作用更强，提示circRNA治疗癌症是可行的［24］。

3.2 CircRNA与其他疾病

除了癌性疾病之外，circRNA还参与其他疾病的发生和发展过程。Circ-ANRIL表达、编码LNK/ARF转录水平和rs1075278与动脉粥样硬化性血管疾病 (atherosclerotic vascular disease，ASVD)相关的单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNP)的基因型有关，而邻近外显子15的一对SNP可影响ANRIL基因的剪接［25］，9p21.3中的常见SNP通过影响ANRIL基因转录和/或剪接来调节LNK/ARF基因的表达。这项研究首次证实了circRNA与人类ASVD之间的关联。circRNA在脑组织中含量丰富，同时也充当着miR-7海绵的角色，因此阿尔茨海默病 (Alzheimer disease，AD)患者海马CA1样品中的CD1Ras明显低于对照者海马CA1样品［26］。CD1Ras的减少可能导致miR-7海绵功能的缺陷，可能是基因在散发性AD脑中下调的主要原因。同样，CD1Ras/miR-7途径在胰岛素转录和分泌中的作用也受到关注。MiR-7过表达可使胰岛素mRNA转录水平下降，并使小鼠胰岛细胞中分泌量降低，而CD1Ras的过表达能够显着上调胰岛素mRNA表达并且胰岛细胞中的分泌颗粒增加。CD1Ras改善胰岛β细胞功能的作用是通过Myrip和Pax6这两个 miR-7靶点实现［27］，此外CircRNA 100783与CD28丢失的CD8+T细胞衰老相关［28］。

3.3 CircRNA与自身免疫性疾病

就自身免疫性疾病而言，20世纪80年代就认为CDR1是导致自身免疫系统疾病的重要基因，它不仅具有抑制免疫力和促进炎症反应的作用，还可以产生抗DNA抗体，从而诱发自身免疫性疾病［29-30］。现已证实 CDR1基因表达一种 CDR1as的环状天然反义转录产物，是人类的一种circRNA［31］。由此可见，circRNA参与自身免疫性疾病的发病和进展。

系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus，SLE)是一种原发性自身免疫性疾病，女性发病多见，男女患病比例为1:9［32］。SLE的特征是慢性炎症过程，可产生针对各种自身抗原的自身抗体［33］，其严重程度可从轻度皮肤病变到主要器官(肾，肺，心脏和大脑)的严重损伤［34］。SLE的病因仍不清楚，但已发现同卵双胞胎SLE患者的病变程度和表现具有高度的一致性，证实该病有一定的遗传基础［35］。除此之外，多个全基因组关联研究证实50多个基因与SLE发病有关，但在患遗传性SLE的单卵双胞胎中这些风险基因的突变位点不一致，因此给判断环境或表观遗传因子在SLE中的作用带来了一定困难［36］。目前公认的与SLE发病相关的表观遗传机制是miRNA基因调节，miRNA内源非编码RNA，长度为19～25 bp，通过引导mRNA降解或抑制mRNA翻译和转录过程调节基因表达［37］。例如，较低水平的miR-146a有助于SLE患者中I型IFN途径的异常活化，miR-30升高则使SLE患者B淋巴细胞过度活化［38-39］。尽管在过去几十年中对SLE发病机制的研究取得了相当大的进展，但该病的诊断和治疗仍未达到预期效果。

目前我们对circRNA的认知仍相当有限，但已有关于miRNA在SLE的作用的研究报道，我们可对circRNA和SLE之间关系进行分析。研究显示，人类基因组编码的约800个miRNA可调节的基因约占三分之一，特别是人类的免疫基因［40-41］。在过去几年中，研究人员发现了一些与T和B淋巴细胞活化［42-43］、炎症细胞因子和趋化因子产生［44-46］、DNA 甲基化［47］和特异性病理特征［48-49］相关的miRNA，认为这些差异表达的miRNA是SLE诊断的生物标志物和潜在治疗靶标。除了这些有关的miRNA在SLE患者中的上述作用外，大多数功能重要的miRNA在免疫应答过程中的表达并未改变［41］。例如，SLE患者的研究样品中未发现miR-326的表达改变，而与 Th17细胞分化相关的miRNA则发生了改变［50］。circRNA表达的改变可影响其与miRNA的螯合能力，引起该miRNA基因靶标的改变。然而，在这个过程中，miRNA的表达水平可以不受影响。以miR-7为例，在CD1Ras过表达后，内源性miR-7的水平不受影响［49］。如果其他circRNA作用方式与CD1Ras相同，我们可以提出假设，即circRNA变化可影响免疫应答中一些正常表达的miRNA的功能，从而促进SLE的发病和进展。因此，关于miR-236与SLE的关系，有可能是某些circRNA的减少导致其屏蔽而不是降低了其表达，从而诱导Th17细胞分化，促进SLE的发展。当然我们不能排除circRNA可以下调某些miRNA的表达，如lncRNA［51-52］。因此，miRNA的海绵circRNA可以通过改变或者不改变miRNA靶点的表达而影响SLE的进程。

一些研究者在初步的研究工作中发现，与健康组相比，SLE患者单个核细胞中显著差异表达的环状RNA有745种，其中182种表达上调，563种表达下调。实时定量PC法验证后发现6种上调环状RNA，即 has_ circ_ 0007337、has_ circ_0007891、has_ circ_ 0001349、 has_ circ_0046555、has_ circ_ 0046215、 has_ circ_0056536;也发现了5种下调 circRNA，即 has_circ_0005480、has_circ_0001854、has_circ_0070113、has_ circ_ 0044468、 has_ circ_0006608，生物信息学提示环状RNA可以通过与miRNA发生相互作用而调控SLE的发生及发展，由此可以得出，SLE患者单个核细胞环状RNA的表达具有疾病特异性，显著差异的和特异性表达的环状RNA可作为SLE诊断的特异标志物。

类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis，RA)是一种以外周滑膜关节慢性炎性病变、关节软骨和骨质进行性不可逆性破坏为特征的全身性自身免疫性疾病。作者发现，与正常人相比，RA患者外周血中显著差异性表达的环状RNA有584种，其中255种表达上调，329种表达下调［53］。此外，Ouyang等［54］分析了RA患者和正常人外周血单个核细胞中circRNA的差异表达，发现了5个与RA密切相关的环状 RNA，分别是 circRNA092516、circRNA003524、 circRNA103047、 circRNA104871和circRNA101873，采用ROC曲线分析法进行判断，发现其中与RA高度相关且可作为RA诊断标志物的是circRNA104781。因此认为circRNA参与RA的发病及进展过程，可能是RA的诊断和治疗靶点。上述研究表明，circRNA与自身免疫性疾病的关系值得关注，其内在联系需要进一步的研究加以验证。

4 展望

虽然从各种RNA-seq数据库中鉴定circRNA面临着挑战，但大量的circRNA的发现扩展了对基因调控复杂性的认识。一般来说，circRNA的形成取决于剪接机制，包括互补重复序列和内含子在环化外显子和环化外显子侧翼的内含子的长度。到目前为止，尽管只有两个circRNA被证实为真正的miRNA海绵，但推测更多circRNA的miRNA海绵作用将会被发现，未来的研究热点可能会更多地关注于circRNA的作用。circRNA中的miRNA结合位点对于miRNA的螯合至关重要，可以通过修饰这些结合位点而发挥circRNA对miRNA活性的抑制作用。比如，能够利用其miRNA海绵的作用，以防止过表达的miRNA在自身免疫性疾病中造成的危害。这种治疗可基于以下前提:miRNA是自身免疫性疾病的主要致病因素，而circRNA可以螯合miRNA。期望未来circRNA的更多功能被发现，利用其作为自身免疫性疾病的早期诊断标志物和治疗靶点的特性，为自身免疫性疾病及其他疾病的彻底治愈奠定基础。