Ⅱ型固有淋巴细胞及其在支气管哮喘中的作用

杨 丹，刘碧翠，刘春涛

作者单位:610041成都，四川大学华西医院呼吸与危重症医学科

支气管哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，既往认为哮喘是由Th2细胞介导的适应性免疫反应。近来研究发现，哮喘的发生是固有免疫与适应性免疫相互作用的结果，两者相辅相承，共同促进气道炎症的发生［1］。固有淋巴细胞 (innate lymphoid cells，ILCs)是新发现的一类具有淋巴细胞的典型形态，但又不表达T细胞、B细胞等免疫细胞的特异性抗原识别受体的细胞，此种细胞在固有免疫应答中具有重要的作用［2］。ILCs根据产生效应细胞因子及涉及转录因子的不同分为3种类型:分泌γ干扰素 (interferon-γ，IFN-γ)、受转录因子T-bet调控的ILC1s，产生2型细胞因子、受GATA结合因子 3(GATA-bindingfactor3，GATA3)和维A酸相关孤核受体α(retinoic acid receptor related orphan receptor α，RORα) 调控的ILC2s以及产生白介素 (interleukin，IL)-17和IL-22、受 RORγt 调控的 ILC3s［3］。近年来关于ILC2s介导的2型免疫应答在支气管哮喘中的作用正日益引起人们的关注，本文就ILC2s及其在哮喘中作用的研究进展作一综述。

1 ILC2s的发现、分布和来源

Fort等［4］于 2001 年首次报道了从 Rag－/－小鼠脾脏中分离出的一种非T、非B的新型细胞，在体外用IL-25诱导后引起IL-4、IL-5、IL-13表达增加，从而产生 Th2样免疫反应，表现为血 IgE、IgG1、IgA水平升高、血液嗜酸性粒细胞增多以及肺脏和消化道嗜酸性粒细胞浸润等病理改变，这种细胞后来被证实为 ILC2s。Mjosberg 等［5］首次在胎儿和成人中发现了Lineage，可表达IL-7R、CD161和Th2细胞趋化因子受体同源分子 (chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on Th2 cell，CRTH2)的细胞群，被命名为人类ILC2s。

ILC2s广泛分布于全身各个部位，在黏膜组织中尤为丰富，肺脏作为人体的黏膜免疫耐受器官，是ILC2s的主要聚集地之一。在哮喘患者或小鼠的外周血、肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、痰液、肺组织、纵隔淋巴结中均可检测到ILC2s［6-9］。与T、B淋巴细胞一样，所有的ILCs均来源于骨髓中的共同淋巴样祖细胞 (common lymphoid progenitor，CLP)。骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)分化成早期淋巴样祖细胞 (early lymphoid progenitor，ELP)，然后进一步发育成CLP，DNA结合抑制因子 (inhibitor of DNA binding 2，Id2)可抑制其向T、B细胞方向分化，而在Notch信号转导、GATA3等的调控下发育为共同 ILC祖细胞 (common ILC progenitors，CILPs)，其中RORα和GATA3高表达的CILPs可定向分化为 ILC2s［10］。

2 ILC2s的调控

2.1 上皮细胞源性细胞因子

最初发现激活ILC2s的介质是上皮细胞源性的细胞因子IL-25、IL-33和胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)。气道的IL-33是ILC2s的主要激活物，有研究报道IL-33信号通路较IL-25表达更迅速，其作用可能更为重要［11］。研究发现，鼻病毒感染人类支气管上皮细胞 (bronchial epithelial cells，BECs)后，其上清液IL-33及2型细胞因子水平均升高;IL-33在上皮细胞-Th2-ILC2s轴中起到关键作用，阻断上游的IL-33比直接阻断2型细胞因子能更加有效地抑制气道炎症［12］。Christianson 等［13］通过阻断小鼠的IL-33受体减少了IL-5+、IL-13+ILC2s的数量，他们设想ILC2s和IL-33之间存在多条前馈和反馈回路以维持哮喘的慢性气道炎症，其中前者是指IL-33刺激ILC2s产生IL-13，而IL-13可诱导气道上皮细胞表达编码IL-33受体的mRNA，从而促进IL-33的自分泌。抗原刺激IL-25和IL-33通路缺陷的小鼠后，其肺泡灌洗液ILC2s数量减少;而对野生型小鼠鼻内给予IL-25、IL-33处理可诱导肺内多种与2型免疫应答相关的基因表达［11］。TSLP由Toll样受体 (toll-like receptor，TLR)激动剂、感染、过敏原所诱导，其在适应性免疫和固有免疫介导的2型炎症应答中均发挥重要作用。鼻息肉上皮细胞表达的TSLP可触发STAT5的磷酸化，促进GATA3表达，介导 ILC2s产生大量2型细胞因子［14］。TSLP受体拮抗剂可减少过敏原诱发的支气管收缩和气道炎症，以TSLP为靶点的新疗法正在尝试应用于临床［15］。鼻病毒感染的小鼠体内IL-25的产生、黏液上皮化生、ILC2s的扩增均依赖于IL-33和TSLP，而TSLP可增强IL-25和IL-33介导的ILC2s基因表达，三者之间复杂的调控机制并不明了［16］。以上研究结果表明，IL-25、IL-33、TSLP均能够激活ILC2s，因组织、实验背景和疾病状态等不同，尚难以评价三者的相对重要性。

2.2 脂质介质

半胱氨酰白三烯 (cysteinyl leukotrienes，Cys-LTs)和前列腺素 D2(prostaglandin D2，PGD2)等脂质介质在ILC2s的活化中也起到重要作用。过敏原特异性IgE诱导肥大细胞活化后产生大量的PGD2，其结合于ILC2s表面的CRTH2致使ILC2s活化，同时伴随IL-25、IL-33受体表达增加，提示CRTH2可能是联系固有免疫和适应性免疫的重要分子，拮抗CRTH2可阻断PGD2的效应，PGD2-CRTH2通路有望成为药物治疗的新靶点［17］。各型CysLTs对ILC2s的迁移均有一定的作用，其强度有所不同，研究显示 LTE4＞LTD4＞LTC4≈IL-33［18］。白三烯E(leukotrienes，LTE4)可增强PGD2和上皮细胞源性细胞因子的作用，在IL-2的协同下使IL-33和IL-25的受体表达上调，共同触发ILC2s的炎症应答［18］。过敏原致敏的 RAG2－/－小鼠以不依赖于STAT6的方式快速产生LTD4，激活ILC2s，使IL-5和IL-13产生增加，并快速促进钙离子内流［19］。与IL-33不同，LTD4诱导ILC2s可产生大量IL-4［19］，对B细胞的活化和增殖可能起到一定的作用。此外，LTC4作用于CysLT1R后二者可发挥协同效应，促使IL-33的活化，增强NFAT1的核转位，使Ki67+IL-5+ILC2s明显增加［20］。以上研究提示脂质介质在ILC2s的活化中发挥重要作用，且对其他激活物有一定的调节作用。

2.3 肿瘤坏死样因子配体

近来研究发现，肿瘤坏死样因子配体 (tumor necrosis factor-like ligand1A，TL1A)受体DR3也存在于 ILC2s，对黏膜免疫应答发挥调节作用。DR3－/－小鼠木瓜蛋白酶鼻内刺激试验不能诱发肺的ILC2s应答，GATA3表达下调，其下游的ILC2s相关基因如IL-13、双调蛋白及ST2的表达受到抑制，提示TL1A/DR3通路对ILC2s的增殖和激活起着重要作用［21］。TL1A对 ILC2s的激活可以独立于IL-25和IL-33，也可以协同两者的作用［21］。

2.4 诱导T细胞共刺激分子及其配体

诱导T细胞共刺激分子 (inducible T cell costimulator，ICOS)属于免疫球蛋白超家族成员。ICOS及其配体 (ICOS/ICOS-L)通路可能通过STAT5信号转导促进 ILC2s的增生、稳态和活化［22］，阻断 Rag2－/－小鼠 ILC2s 的 ICOS/ICOS-L，可明显减弱IL-33介导的气道高反应性和气道炎症［22］。研究者还发现，ICOS－/－小鼠早期凋亡(Annexin V+，DCD－)、晚期凋亡 (Annexin V+，DCDint)及死亡 (DCD)数目均较野生型有所增加，可能与抗凋亡因BC子L-2在ICOS－/－ILC2s中明显减少有关［22］。诱导调节 T细胞 (induced Tregs，iTregs)的ICOS与ILC2s的ICOS-L相互作用伴随着抑制性细胞因子TGF-β和IL-10的产生，可有效地抑制ILC2s介导的促炎介质生成［23］。

2.5 蛋白激酶Cθ

蛋白激酶 Cθ (protein kinase C theta，PKCθ)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，其作用与转录因子干扰素调节因子4(interferon regulatory factor 4，IRF4)和激活T细胞核因子 (nuclear factor of activated T cells，NFAT1)的表达有关，通过激活ILC2s可能促进Th2细胞的活化和增殖［24］。

2.6 微小RNA-155

微小RNA(microRNAs，miRs)属于非编码小RNA，在过敏性气道炎症中，IL-33活化引起ILC2s增生且 miR-155表达上调10倍，而 miR-155－/－ILC2s增殖减少，GATA-3和 ICOS表达降低，引起IL-13产生减少，但IL-5的变化并无统计学意义的差异，提示miR-155对ILC2s的功能有直接调节作用［25］。

2.7 抑制性调节因子

脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)和前列腺素I2(prostaglandin I2，PGI2)也属于脂质递质，近来被认为是ILC2s的负调节因子。LXA4是一种天然促炎症消退的配体，与ILC2s上的ALX/FPR2受体结合可显著地减少IL-13的分泌，提示LXA4可以靶向抑制ILC2s，从而减轻气道炎症［7］。内源性PGI2可与其受体IP结合，在一定程度上通过蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)通路抑制ILC2s的增殖来抑制过敏性炎症［26］。此外，有学者提出将小鼠肺脏中的ILC2s分为2种亚型，其中炎症型ILC2s(inflammatory ILC2s，Lin-ST2-KLRG1hi)是短暂存活的前体细胞，通过炎症和感染激活上调γc和 IL-7Rα而发育成为自然 ILC2s(natural ILC2s，Lin－ST2+KLRG1int)，前者表达有大量杀伤细胞凝集素样受体G1(killer cell lectin-like receptor G1，KLRG1)，对 ILC2s的功能具有调节作用［27］。自然 ILC2s表达一定量的 RORγt并产生大量的ILC3s样细胞因子IL-17，提示其与ILC3s可能存在转化［27］。Maresin-1也是一种特异性促炎症消退介质，可促进Tregs细胞的更新，并抑制ILC2s及CD4+T细胞产生IL-5和IL-13，加速过敏性炎症的消退［28］。用 γ 干扰素 (interferon-γ，IFN-γ) 处理鼻病毒感染的幼稚小鼠可使ILC2s扩增减少，并减弱IL-13、黏液相关基因Muc5ac mRNA的表达及黏液上皮化生［29］。

3 ILC2s与其他细胞间的联系

3.1 ILC2s与Th2细胞

Th2细胞和ILC2s分别介导适应性免疫和固有免疫应答，是免疫系统不可分割的两个方面，其相互作用机制仍未完全明了。已有研究表明，ILC2s和CD4+T细胞可通过不同的机制相互激活彼此的功能，具有正向调节作用［30-33］。OVA致敏小鼠再次使用过敏原时可诱发回忆应答，ILC2s可增强过敏原特异性CD4+Th2细胞所介导的气道炎症［31］。寄生虫感染ILC2s缺乏的小鼠后Th2细胞的免疫应答明显减弱，或许可以用ICOS+CD4+T细胞上白喉毒素 (diphtheria toxin，DTx)相关的脱靶效应来解释，而ILC2s对CD4+T细胞的激活可能与其表达的主要组织相容性复合体II(major histocompatibility complex，MHCII) 有关［33］。ILC2s 可通过细胞接触依赖的方式调节未致敏的T细胞，促进其定向分化为Th2细胞，而抑制其向 Th1细胞分化［32］。ILC2s在共刺激分子CD80、CD86共同作用下，向CD4+T细胞呈递抗原，增强其免疫应答［32］;而T细胞产生的IL-2可促进ILC2s的增殖和IL-13的产生［31-32］。也有研究发现，BALF中CD4+T细胞激活早于IL-5+IL-13+ILC2s的增殖，提示ILC2s的激活可能依赖于T细胞的作用［34］。然而，有研究报道，固有免疫可独立于适应性免疫而存在，即使没有适应性免疫的参与，ILC2s也可产生2型细胞因子、诱导嗜酸性粒细胞炎症［8，35-36］。

3.2 ILC2s与B细胞

Moro等［37］从脂肪相关淋巴簇 (fat-associated lymphoid clusters，FALC)中分离出ILC2s，其分泌的IL-5可促进CD23-B1细胞的分裂，并伴随IgA的产生增多，而CD23+B2细胞却罕见分裂，提示ILC2s产生的IL-5对B1细胞的自我更新具有调节作用;新近研究发现，肺组织中的ILC2s可同时促进B1、B2细胞的增殖［38］。两项研究的结论不完全一致，原因可能是两者ILC2s来源的组织有所不同，其免疫调节机制尚待进一步研究。

3.3 ILC2s与嗜酸性粒细胞、中性粒细胞

IL-5和嗜酸细胞活化趋化因子 (eotaxin)可介导嗜酸性粒细胞的发育、增殖、活化和组织聚集。嗜酸性粒细胞可作为下游效应细胞参与ILC2s介导的气道免疫反应，这种调控作用取决于多种外界因素。研究发现这可能与表面KLRG1的表达和IL-5重组酶表达探测器 (recombinase-expressing detector for IL-5，R5)的多因素遗传有关，当受到感染或炎症刺激时，肺内R5/R5 RAG－/－ILC2s分泌大量的IL-5，并上调IL-13，刺激上皮细胞产生大量的eotaxin-1(CCL11)，促进嗜酸粒细胞性炎症［39］。此外，ILC2s基因敲除的小鼠，肺内IL-1β、肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor-α，TNF-α) 和 IL-23等表达增加，激活γδT细胞以快速产生IL-17A，并促进中性粒细胞聚集，提示ILC2s对中性粒细胞可能具有抑制作用［40］。

3.4 ILC2s与其他免疫细胞

除上皮细胞外，各种类型的免疫细胞也可分泌IL-33，包括自然杀伤T细胞 (nature killer T cells，NKT cells)、肺泡巨噬细胞 (alveolar macrophage，AM)、树突状细胞 (dendritic cells，DCs)和肥大细胞等。糖脂抗原可直接激活NKT细胞，也可以刺激肺泡巨噬细胞产生IL-33，进而活化ILC2s和NKT细胞，使IL-13产生增多，引起气道高反应性［41］。ILC2s来源的IL-13可诱导DCs分泌Th2细胞趋化因子 CCL17，进而产生记忆 Th2细胞应答［42］。近来研究发现，过敏原刺激可通过激动Toll样受体7/8(TLR-7/8)激活浆液样树突状细胞 (plasmacytoid dendritic cells，pDCs)，产生大量IFN-α，通过增强干扰素调节因子-7(interferon regular factor 7，IRF-7)、STAT-1、STAT-2 等促凋亡相关信号通路，抑制mtor、Pi3k-α、Rac1等相关基因表达，从而抑制ILC2s增生并诱导其凋亡，减弱气道高反应性［43］。

3.5 ILC2s在哮喘中的作用

近来研究表明ILC2s在哮喘的发生发展中发挥重要作用。缺乏T、B细胞的小鼠仍保留了一定的气道高反应性 (airway hyper reactivity，AHR)，而同时缺乏ILC2s的小鼠完全不具有AHR，不能维持哮喘的慢性炎症［13］。ILC2s产生大量的 IL-5、IL-9、IL-13，同时分泌极少量的IL-4、IL-6等细胞因子，共同促进哮喘炎症的发生［6，8，44］。此外，ILC2分泌的双调蛋白可促进肺脏组织修复，提示ILC2s在哮喘中或可起到一定的保护作用［45］。

3.6 ILC2s与早发过敏性哮喘

早发过敏性哮喘一般认为与I型变态反应及2型细胞因子的释放有关。研究发现，在过敏性哮喘(allergic asthma，AA)、过敏性鼻炎 (allergic rhinitis，AR)及健康者均有ILC2s及IL-5、IL-13的产生，而在 AA组显著高于 AR组和健康者［44］。GATA3和p38 MAPK等分子的表达和磷酸化可能提供关键的调节信号，这些生化特征也许可能解释ILC2s在AA和AR等不同疾病中所发挥的潜在作用的差异［44］。过敏性哮喘患者予以变应原鼻内激发试验6小时后鼻黏膜的ILC2s募集增多，IL-5、CCL17/TARC等 Th2型细胞因子、脂质介质PGD2、嗜酸粒细胞趋化因子CCL26/eotaxin-3以及促炎介质IL-6表达都有所增多，且与症状的严重程度呈正相关，表明ILC2s在气源性过敏原诱发的早期气道过敏反应中起到了重要作用［46］。OVA或HDM诱发哮喘的动物模型中，ILC2s在肺脏和BALF中分别占了IL-5+/IL-13+细胞总数的50%和80%，提示ILC2s是2型细胞因子的主要来源［8］。Halim等［47］研究发现，木瓜蛋白酶可损伤气道上皮细胞，促进野生型和 Rag1－/－小鼠 IL-33的释放，进而激活肺自然辅助细胞 (lung natural helper cells，LNH cells，后证实为ILC2s)，引起嗜酸性粒细胞浸润以及黏液高分泌，而 Rag2－/－Il2rg－/－小鼠因缺乏LNH细胞IL-5和IL-13明显减少。以上大量研究证实了ILC2s在过敏性哮喘中的重要地位，而ILC2s的数量和活性与哮喘的严重程度或急性加重是否有关尚需进一步探索。

3.7 ILC2s与迟发嗜酸性粒细胞哮喘

迟发性哮喘多为非过敏性哮喘，通常与暴露于相关环境因素如病毒感染、空气污染、烟草、柴油颗粒等相关，可伴有鼻息肉、慢性鼻窦炎等，也常伴随有持续性嗜酸性粒细胞浸润。慢性鼻-鼻窦炎患者的鼻息肉内可检出 ILC2s［5］。Jackson 等［12］通过鼻病毒感染建立哮喘急性发作的动物模型，发现其支气管上皮细胞释放 IL-33，激活 T细胞及ILC2s，相对Th0细胞而言ILC2s可产生200倍的IL-5和100倍的IL-13。此外，病毒可通过激活Toll样受体 7(Toll-like receptor 7，TLR7)和NLRP3炎症小体，从而导致肺泡巨噬细胞释放大量IL-33，经由 IL-33-ST2信号转导使得 ILC2s活化［36］。

3.8 ILC2s与肥胖相关性哮喘

肥胖可能增加哮喘急性发作的风险，ILC2s与ILC3s可能在肥胖相关性哮喘中具有重要作用。高脂饮食所致肥胖使得HDM致敏小鼠的过敏性气道炎症 (airway allergic inflammation，AAI)急性加重，肺内 ILC2s、NCR-ILC3s、CD4+T 细胞和 IL-13、IL-4、CCL11以及IL-17产生增多，引起气道反应性增高，可能与ILC2s上RORα的高表达有关［9］。而ILC2s与ILC3s在肥胖相关性哮喘中的贡献及Th2/TH17型免疫应答的相对重要性尚需更多的研究加以评价。

3.9 ILC2s与重症哮喘

重症哮喘患者痰液和外周血中ILC2s较轻症患者明显升高，虽然痰液中CD4+T细胞绝对计数明显高于ILC2s和嗜酸性粒细胞祖细胞 (eosinophil progenitors，EoPs)水平，但ILC2s是2型细胞因子的主要来源［6］。重症哮喘患者痰液中 IL-5+IL-13+ILC2s水平明显升高，伴有痰嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)增多，而外周血并无明显变化，可能与ILC2s分泌的IL-13促进原始祖细胞的肺部迁移和IL-5驱动局部细胞的成熟有关［6］。此外，仅有IL-5+ILC2s显著升高，IL-13+ILC2s的升高并无统计学意义，提示不同功能状态的ILC2s在重症哮喘中的作用有所差别［6］。另有研究报道外周血中ILC2s水平在健康者、轻度哮喘、重度哮喘患者之间并无显著性差异［7］。这些研究结果的差异是由于外周血中ILC2s数量极少，利用外周血来比较ILC2s数量有一定的困难，抑或是ILC2s在肺脏局部的聚集与外周血分布不一致尚不清楚，而其作用的具体机制也有待进一步探索。

3.10 ILC2s与糖皮质激素抵抗型哮喘

ILC2s对糖皮质激素的应答在不同物种、不同个体和不同环境中可能存在差异。真菌过敏原致敏的小鼠予以地塞米松干预后肺组织Ki-67+ILC2s减少，凋亡增加，提示ILC2s可能对糖皮质激素有反应［48］。在轻度哮喘患者的过敏原激发试验中，ILC2s和CD4+T细胞均可被激活，而地塞米松明显减弱了 IL-2和 IL-33活化的两种细胞的 IL-5、IL-13的产生，且这种抑制作用呈现剂量依赖性［49］。然而，大多数研究显示人类ILC2s可能对糖皮质激素治疗并不敏感。哮喘患者尽管使用了大剂量口服糖皮质激素，ILC2s仍可在局部产生大量2型细胞因子致使气道炎症持续存在，提示ILC2s可能对糖皮质激素抵抗［6］。ILC2s产生糖皮质激素抵抗的生物学机制并不清楚，研究发现TSLP抑制地塞米松诱导的自然辅助细胞 (natural helper cell，NHC)即ILC2s凋亡，可能与TSLP对STAT5磷酸化的调控有关，使用TSLP的中和抗体和STAT5抑制剂阻断TSLP/STAT5信号通路可以在一定程度上恢复糖皮质激素敏感性［50］。此外，IL-2、IL-7、IL-9也可以诱导糖皮质激素抵抗，而IL-27则与之相反［50］。Liu 等［51］研究发现，外周血中 ILC2s对糖皮质激素敏感，而BALF中ILC2s对糖皮质激素抵抗，可能与局部TSLP水平升高有关。地塞米松使得ILC2s的IL-7Rα表达上调，通过TSLP诱导甲基乙基酮 (methyl ethyl ketone，MEK)、c-Fos、ID3、pSTAT3、pSTAT5等糖皮质激素抵抗相关分子产生，其中MEK和pSTAT5不能被地塞米松所抑制。ILC2s在个体之间或在不同环境对糖皮质激素的反应是否有所不同，及其作用机制仍值得探究。

4 总结

ILC2s是一种新型的固有淋巴细胞亚群，其发现为研究固有免疫和适应性免疫之间的联系开辟了新的路径。近年来，对于ILC2s在哮喘发病过程中作用的研究取得了重大突破，但仍有大量的问题有待进一步探索研究，譬如固有免疫与适应性免疫之间具体的相互作用及相对重要性、ILC2s介导难治性哮喘的作用机制、ILC2s与ILC3s在肥胖性哮喘中的主导地位以及病毒感染激活ILC2s触发非过敏性哮喘的具体机制等。值得肯定的是，目前的研究显示通过靶向调控ILC2s的途径控制哮喘的炎症具有广阔的治疗前景。