细胞焦亡的分子机制及其在病毒感染中的作用

张克恭 王建 张野 黄长形

710038西安，空军军医大学第二附属医院传染科

细胞焦亡（pyroptosis）是细胞程序性死亡的一种方式。与凋亡不同的是，细胞焦亡伴随着炎症反应，在形态学上同时具有坏死和凋亡的特征。细胞焦亡的发生首先由模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别病原相关分子模式（pathogenassociated molecular pattern，PAMPs）和危险相关分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs），而后促进炎症小体的转录和表达。细胞焦亡分为经典途径和非经典途径。半胱天冬氨酸蛋白酶（caspases）是细胞焦亡中起关键作用的蛋白酶，经典途径由半胱天冬氨酸蛋白酶1（caspase-1）介导，而非经典途径中由Caspase-4／5／11介导。Caspases可以诱导gasdermin-D（GSDMD）的活化和炎症因子白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）和 IL-18 的分泌，引起细胞肿胀、溶解和炎症反应［1-6］。

1 细胞焦亡的形态学特征

细胞焦亡形态学上同时具有细胞凋亡和细胞坏死性死亡的特征。一方面，发生焦亡的细胞会有核固缩和DNA的破坏，而细胞核在形态上会保持完整性［7］，无核碎裂表现。胞质内细胞器也保持完整，但其功能何时丧失仍不清楚，有实验表明，发生焦亡的骨髓来源巨噬细胞，在细胞膜穿孔形成1分钟内，线粒体就停止了活动［8］。焦亡细胞在最终溶解之前，会形成焦亡小体，焦亡小体直径约为1～5μm，游离的焦亡小体可以被专职的吞噬细胞吞噬，或者作为细胞间传递物质和信息的载体［9］。另一方面，发生焦亡时，细胞膜的完整性会遭到破坏，GSDMD在质膜形成的穿孔，会打破胞膜两侧的渗透平衡及导致炎症因子的释放，细胞体积增大最终溶解，细胞内容物释放到外界，并引起炎症反应［10-11］。

2 细胞焦亡的分子机制

2.1 细胞焦亡的第一步是炎症小体的活化 在细胞遭遇感染或免疫反应时，PRR识别 PAMPs或DAMPs，促进炎症小体的转录和装配。炎症小体是胞质内的多聚蛋白体，由炎症小体启动传感器（NLRP1，NLRP3，NLRC4，AIM2，pyrin等）和参与炎症反应的Caspases构成，有的还包括配体蛋白凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）［12］。 经典炎症小体大部分属于 NOD样受体（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor，NLRs）家族。 NLRs家族包含3个共同结构域，C端富含亮氨酸结构（leucine-rich repeats-LRR），中间为核苷结合域（NOD／NACHT），N 端为Caspase募集域（caspase activation and recruitment domain-CARD）或脓素域（pyrin domains-PYD），各结构域行使不同的功能，LRR负责配体识别和自抑制作用，能识别其他炎症受体或微生物配体；NACHT消耗ATP激活信号复合体，与核苷酸rNTP结合并调节寡聚反应；CARD／PYD调节同型蛋白之间的交互作用，有调节信号通路的作用。另一种焦亡相关炎症小体AIM2为非NLRs蛋白，有一个脓素域和DNA结合HIN-200域，HIN200结构可识别dsDNA。不同炎症小体应对不同的刺激性质：NLRP3能被许多激动剂激活，如ATP、穿孔毒素、晶体化合物、核酸、透明质酸、以及真菌、细菌、病毒等病原体；NLRP4识别胞内细菌鞭毛蛋白、3型分泌系统元件；NLRP1识别炭疽致死毒素、胞壁酰二肽；AIM2识别胞质双链 DNA［10-11，13-14］。

炎症小体的活化还需要ASC的参与，ASC结构包含CARD和PYD，是炎症小体和Caspases连接的桥梁［14］，炎症小体通过ASC与Caspases相互作用，活化Caspases，主要是Caspase-1，最终形成链式复合物或者球形复合物［7，15］。

2.2 Caspase-1／4／5／11 是介导细胞焦亡的重要物质 Caspases是进化上保守的胞内酶，与细胞死亡和炎症反应密切相关，定位于胞质和核质［15］，各Caspases参与不同的生化过程，凋亡相关的有Caspase-2／3／6／7／8／9／10；焦亡相关的有人 Caspase-1／4／5 和鼠 Caspases 1／11，被 列 入 炎症 相 关Caspases亚族。细胞焦亡分两种途径：经典途径和非经典途径。经典途径由Caspase-1介导，Caspase-1以前体的形式存在于胞质中，炎症小体是Caspase-1活化的场所，CARD募集Caspase-1前体，Caspase-1前体二聚化，而后发生解朊反应，这是一个自催化的过程，产生p10 a和p20的亚单位，最终成为有活性的Caspase-1。NLRs或AIM2活化Caspase-1需要ASC的参与，另一种炎症小体NLRC4不依赖ASC，直接募集Caspase-1前体并催化Caspase-1活化［11，16-17］。 Caspase-1 活化后可进一步激活细胞焦亡的效应蛋白GSDMD以及炎症因子的成熟和释放。

细胞焦亡的非经典途径在人类由Caspase-4／5介导，在小鼠由Caspase-11介导。这一途径识别的PAMPs主要是脂多糖（LPS），Caspase-11直接与LPS的脂质A结合，尤其是六酰脂质A，在此过程中，Caspase-11本身就是PRR，在应对革兰阴性菌的感染中发挥重要作用［13，18］。 人类 Caspase-4／5 有相同的功能。细胞焦亡是一个复杂的生化过程，各信号通路并非是相互孤立的，经典与非经典途径会有交叉，如Caspase-11可以促进NLRP3的活化，进而导致Caspase-1的活化和炎症因子的释放［18］，炎症小体还可以通过 Caspase-4／5／11 活化 Caspase-1［19］。此外，近来又发现其他Caspases也可能参与细胞焦亡［20］。因此，对于细胞焦亡过程中Caspases的活化通路及不同Caspases相互作用仍需要进一步的研究。总之，焦亡相关Caspases是介导细胞焦亡的关键酶类，它活化之后能够水解焦亡的执行蛋白GSDMD，引起细胞穿孔，肿胀，溶解。

2.3 GSDMD是细胞焦亡的执行者 GSDMD属于Gasdermin蛋白家族，在许多细胞如巨噬细胞，上皮细胞等都有表达。Gasdermin蛋白进化上很保守，各成员有45%序列同源，主要在 N端。人类有GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、DFNA5 和DFNB59，小鼠没有 GSDMB，但有 3种 GSDMAs（GSDMA1-3），4 种 GSDMCs （GSDMC1-4）［13，21］。GSDMD目前研究最透彻。GSDMD约由480个氨基酸组成，N端是功能区域，能在胞膜上形成穿孔，也叫PFD结构域 （Pore-forming domain），PFD的中心结构为延伸的β折叠，GSDMD的C端是一个α螺旋组成的袋状结构，对N端有抑制作用，因此也叫RD结构域（repressor domain），GSDMD处于未活化状态时，PFD和RD结合在一起，掩盖各自约30%的表面。执行焦亡时，GSDMD一个保守的谷氨酸残基被Caspase-1或Caspase-11水解成GSDMD-N和GSDMD-C，GSDMD-N从GSDMD-C的抑制下解放出来，GSDMD-N对磷脂有亲和性，尤其磷脂酰肌醇磷酸盐，细胞膜胞质侧富含此类磷脂，GSDMD-N结合到细胞膜上，形成一个16单体环状聚合物，在细胞膜上形成穿孔，内径12～14 nm，也有研究显示为21 nm，穿孔破坏了细胞膜的完整性，尤其是破坏了钠钾平衡，钠离子大量内流，细胞渗透性吸水，体积变大，穿孔数量不多时，细胞会启动补偿机制，通过K＋、Cl-、有机渗透物等维持水平衡，或通过胞膜融合修补穿孔。穿孔数量过多时，细胞充满液体呈气球样，质膜从细胞骨架脱离，最终细胞破裂溶解，死亡。由于GSDMD-N高亲和力基团在细胞膜胞质侧，因此GSDMD-N不会对周围细胞造成损伤。此外，细菌细胞壁含有心磷脂，GSDMD-N能与之结合并发挥穿孔功能，具有直接杀菌作用［16，22-23］能直接杀死大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，芽孢杆菌等［24］。Gasdermin蛋白家族除了DFNB59，都有相同的N端结构域，都可能具有穿孔活性［25］，这需要进一步的研究。

细胞发生焦亡时加入细胞溶解抑制剂后，细胞未发生溶解，但依然存在细胞运动和线粒体活动的停止和细胞肿胀，表明发生焦亡时，细胞死亡和细胞溶解是独立的，死亡在溶解之前。抑制溶解也并不能保护细胞免于焦亡，但可以推迟炎症的发生。当抑制GSDMD时，在相同刺激下，细胞发生凋亡［26］。说明 GSDMD是细胞焦亡所必须的，通过检测GSDMD可以反映相关Caspases的活化和焦亡的发生［27］。

2.4 细胞焦亡与炎症反应 细胞焦亡一个重要的特征是伴随着炎症的发生，这需要炎症因子参与。活化的Caspase-1能促进IL-1β和IL-18的成熟和分泌。IL-1β在宿主防御和启动保护性炎症中发挥重要作用。它的前体被Caspase-1水解而变为活性形式，IL-1无信号肽，不经内质网、高尔基体分泌。细胞溶解之前，IL-1β即可经GSDMD形成的穿孔分泌，可能会促进周围细胞IL-1β前体的生成以及募集更多的免疫细胞。细胞溶解之后，炎症因子和大分子物质都会释放，引起炎症反应［20，28-29］。 非经典途径中，Caspase-11直接调控IL-1α的分泌，并通过NLRP3-ASC-Caspase-1 间接促进 IL-1β 的分泌［11］。

3 细胞焦亡在病毒感染发病中的作用

细胞焦亡是一种伴随炎症反应的程序性死亡方式。在病毒感染发病的过程中，细胞焦亡起着很重要的作用。

3.1 急性病毒感染 研究表明，细胞焦亡在肠道病毒71（enterovirus 71，EV-A71）感染早期就被启动，EV-A71病毒诱导Caspase-1的活化，继而被感染细胞的 IL-1β和 IL-18的表达和分泌明显增加，Caspase-1抑制剂可使鼠脑中EV-A71病毒的复制显著下 降［30］。 与 此 相 似， 在 柯 萨 奇 病 毒 B3（Coxsackievirus B3，CVB3）感染的宫颈癌细胞中，IL-18和NLRP3表达增强。在CVB3感染的小鼠中，Caspase-1抑制剂能够减轻症状以及减少病毒复制。此外，IL-1β的释放还能促进 Caspase-1的表达，形成正反馈，在EV-A71和CVB3的急性感染期细胞焦亡能促进病毒的释放和传播，导致更多细胞的感染，这一阶段细胞焦亡是有害的。

登革病毒（dengue virus，DENV）主要侵犯巨噬细胞，在DENV-2感染中，病毒会引起巨噬细胞分泌IL-1β并发生焦亡，这个过程受 Caspase-1和Caspase-4的调节［10］。在Theiler氏小鼠脑脊髓炎病毒感染SJL／J小鼠中，脊髓细胞大量发生细胞焦亡，被感染小鼠的Caspase-1、-11基因表达上调。感染过程中，细胞焦亡导致过多的细胞因子释放，从而加重了炎症反应和细胞毒性［30］。

3.2 慢性病毒感染 细胞焦亡也参与慢性病毒感染过程，如人类免疫缺陷病毒（HIV），在抗逆转录病毒治疗的 HIV患者中，治疗无效组 NLRP3和Caspase-1的表达明显上调，二者在HIV感染持续免疫激活中起作用，Caspase-1表达上调，CD4 T细胞发生细胞焦亡，数量减少［31］。在HIV-1感染患者的次级淋巴组织中，流产感染的CD4＋T细胞会发生焦亡，而在外周血中，CD14＋＋CD16-单个核细胞发生细胞焦亡后，会将ASC释放入血，ASC可能对HIV-1引起的炎症反应和免疫激活有促进作用［32］。

4 小结

细胞焦亡作为一种程序性死亡形式，对于生物的正常的生理功能是非常重要的，也是机体固有免疫的重要组成部分，对于清除受损细胞和抵御感染等方面都有重要的作用。当发生过度的细胞焦亡时，也会造成较强的病理性炎症反应。对于细胞焦亡的发生，信号通路及关键分子，还需要更深入的研究，相信这可以为了解相关疾病发病机制，提供新的思路，为疾病的治疗提供新的靶点。

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