少见尖端赛多孢子菌致脑组织感染1例及系列研究

周馨 马筱玲 叶书来 鲁怀伟 王影

(中国科技大学附属第一医院检验科，合肥 230001)

尖端赛多孢子菌 (Scedosporiumapiospermum)以前被称为尖端单孢子菌，普遍存在于自然界，其有性生活阶段是波氏假阿利什霉 (Pseudallescheriaboydii)[1]。尖端赛多孢子菌是条件致病真菌之一，偶可导致无症状真菌定植或局部感染, 在免疫力低下者可发生播散性或系统性真菌感染。现将我院收治的1例尖端赛多孢子菌感染患者的临床症状、致病菌的鉴定和抗真菌药体外敏感试验报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

患者女，51岁，因发现肺部及颅内占位，且合并干燥综合症，于2017年10月12号入院。患者无明显诱因出现右侧肢体无力、麻木，伴有体温升高，最高达39℃，白细胞11.26×109/L，葡聚糖15.82 pg/mL，CRP 58.9 mL/L。入呼吸科，头颅胸部CT提示：①左顶叶占位；②两肺多发结节 (见图1)。进一步治疗转入脑外科，积极完善相关检查。除手术禁忌症，在全身麻醉下行左颞顶开颅颅内病灶切除。脑部引流物做病理组织学检查，细菌培养和镜检涂片。病理组织学显示：左颞顶肉芽肿性炎，内见胶质细胞增生，伴少量淋巴细胞，多核巨噬细胞浸润，局部可见真菌菌丝和孢子，见图2箭头所示。术后以抗感染，支持治疗，后突发昏迷，CT提示肺部大片炎症，颅内病变术后，转入ICU。在ICU给予抗真菌药，以伏立康唑为主，甘露醇脱水降低颅内压，预防癫痫，针对干燥综合症请风湿免疫科会诊予以激素及免疫抑制剂等治疗，维持循环及内环境稳定，加强营养支持，纠正电解质紊乱等对症治疗处理。动态复查肺部CT呈逐渐好转，颅内水肿逐渐减轻。一度体温趋于正常，肺部感染改善，脑部肿胀消退，生命体征基本稳定。但患者最后因蛛网膜下腔出血导致死亡。

1.2 形态学检查

直接镜检 将颅内病灶部分脓性引流物标本直接镜检涂片，并接种沙氏培养基、真菌培养平板和血培养皿，35℃培养，在培养第5天和第10天观察菌落及单个菌落形态。取部分培养真菌压片，在显微镜下观察真菌形态特征。

真菌荧光镜检 挑取样本制成涂片干燥后固定，用荧光染料染色。先加一滴A液覆盖于标本，然后直接在标本上加一滴B液，盖上盖玻片，染色2分钟，于荧光显微镜 (波长340～380 nm)下观察形态。

1.3 分子生物学鉴定

采用石碳酸法[2]提取真菌DNA。采用真菌通用引物ITS1 (tccgtaggtgaacctgcgg)和ITS4 (tcctccgcttattgatatgc)，rDNAITS区域的PCR扩增和序列测定。反应条件：94℃ 85 s，95℃ 35 s，55℃ 55 s，72℃ 45 s，共35个循环，72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物经过浓缩，纯化后用DNA测序仪测序。序列结果在基因库核酸序列数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih/blast)中进行同源性序列搜索。

1.4 药敏试验

根据美国CLSIMP-38A方案[3]，E-test真菌药敏试验，将产孢丰富的真菌用生理盐水制成标准的0.5麦氏单位浓度的真菌孢子悬液，密涂于RPMI 1640培养基，35℃孵育48 h后读取结果，判读两性霉素B、氟康唑和伏立康唑药敏结果。

2 结 果

2.1 真菌学检查

颅内脓性引流物标本直接镜检涂片，见图3，可见大量菌丝和孢子，由于分泌物杂质太多，菌丝和孢子镜检不是很清晰，不能明确判断。将分泌物在血平板培养，真菌培养板和沙保罗培养5 d后，单个菌落为白色棉花状小菌落，10 d后菌落颜色开始变深，菌落变大，如羊毛样，有褶皱感，见图4。取部分菌落组织制片，在显微镜可清晰见到有隔菌丝、较粗；分生孢子梗侧生或顶生，梗端着生单个分生孢子，分生孢子椭圆形，环痕产孢，有时可产生多个孢子，见图5。荧光显色更加清晰，见图6，低倍镜真菌荧光染色显示大量真菌的菌丝及孢子均呈亮蓝色，其他细菌和组织呈弱蓝色荧光，背景为蓝黑色。高倍镜下较粗的菌丝和大量孢子发出亮蓝色荧光，孢子着生于菌丝顶端，椭圆形。通过形态学初步鉴定为尖端赛多孢子菌。

2.2 rDNA序列分析

rDNA ITS间区序列在基因库核酸序列同源性搜索，结果与基因库编号为菌株UASWS1162相比，其基因序列同源性为99%，证明此临床菌株为尖端赛多孢子菌。ITS间区568 bp。基因库注册号分别为:gi748806742，KM279976。

2.3 药敏结果

三种药敏结果显示为两性霉素B>32 μg/mL、氟康唑>32 μg/mL和伏立康唑0.064 μg/mL。

3 讨 论

尖端赛多孢子菌普遍存在于自然界中，如土壤、污水、腐物等，在恶性肿瘤、器官移植、长期应用激素或免疫抑制剂等免疫力低下患者可引起严重感染或感染扩散[4]。近年研究发现, 尖端赛多孢子菌引起的感染大部分为深部感染。该患者自身合并干燥综合症，曾使用大量免疫抑制剂，造成免疫低下，且伴有肺部严重的感染。有文献报道[5-7]，脑部易发生尖端赛多孢子菌感染，并导致颅内脓肿形成，这与该患者脑部较大占位性病变一致。

按照感染病研究院真菌病研究组 (EORTC/MSG)的标准，诊断尖端赛多孢子菌感染，需从感染部位取标本，通过组织学和 (或)细胞学证实，并从其霉样培养物中分离出该菌[8]。该患者通过影像学报告显示脑部占位病变，因此行左颞顶开颅颅内病灶切除，取脑部组织做病理组织学检查和脑部引流物做细菌培养，病理组织结果证实脑部组织有菌丝和孢子浸润。尖端赛多孢子菌有特异的形态，通过对纯培养菌落直接镜检和真菌荧光染色制片，初步鉴定为尖端赛多孢子菌。本文是国内少见用真菌荧光染色技术制片尖端赛多孢子菌，图5可清晰见到发出亮蓝色的真菌菌丝和孢子，形态典型。尖端赛多孢子菌所致的脑部感染病理资料也是比较少见，如图2所示，清晰可见脑部组织中有真菌菌丝和孢子感染。DNA检测技术是最为可靠的检测手段，也是国际承认的菌株鉴定的金标准，该菌从基因库菌株比对尖端赛多孢子菌结果为99%，更加明确了诊断，对临床诊治提供很大的帮助。

图1入院时患者头颅和胸部CT检查结果图2脑部病理组织学检查结果图3引流物标本直接镜检和真菌纯培养镜检 (×40)图4尖端赛多孢子菌5 d培养和10 d培养图5引流物标本直接镜检和真菌纯培养镜检 (×40)图6尖端赛多孢子菌荧光染色 (a.×10,b.×40)

Fig.1Head and chest CT results at admissionFig.2Histopathological examination of the brainFig.3Direct microscopy and fungal culture microscopic examination of drainage specimens (×40)Fig.45 d and 10 d culture results ofScedosporiumapiospermumFig.5Direct microscopy and fungal culture microscopic examination of drainage specimens (×40)Fig.6Fluorescence staining ofScedosporiumapiospermum(a.×10,b.×40)

资料表明[9]，抗真菌治疗和手术去除脓肿对尖端赛多孢子菌感染的治疗具有双管齐下的作用。目前常用的抗真菌类药物如伊曲康唑、氟康唑等在体外表现出较低的尖端赛多孢子菌的抑菌活性，而新型的三唑类药物、伏立康唑等具有较高的生物敏感性，这与本文药敏试验两性霉素B和氟康唑耐药，伏立康唑敏感相符合。目前，FDA (Food and Drug Administration，FDA)已批准伏立康唑用于治疗尖端赛多孢菌的感染[10]。同时也有报道采用脑脊液引流和抗真菌联合用药 (如伏立康唑、特比萘芬和卡泊芬净)，成功治愈尖端赛多孢子菌颅内感染[11]。本例患者在脑部脓肿摘除后，在ICU给予伏立康唑治疗4周后，肺部感染改善，脑部肿胀消退，生命体征基本稳定，患者病情得到了很好的控制。可见使用伏立康唑抗真菌治疗同时使用免疫抑制剂，加强营养等辅助治疗对治疗尖端赛多孢子菌感染有很大的帮助。