白念珠菌耐药机制研究进展

王航 阎澜

(1.第二军医大学基础医学院学员八队，上海 200433；2.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

近年来，随着广谱抗生素的长期使用，肿瘤患者放化疗治疗增加、免疫抑制剂使用增多，临床侵袭性真菌感染发病率有显著提高的趋势。白念珠菌是一种定植于人体内的机会致病菌，在患者手术后、免疫系统功能低下或长时间使用外源材料导入时，会有很大概率引发念珠菌血症等临床感染，约占医院获得性败血症病例的15%[1]，死亡率高达30%～40%。经典抗真菌药物有唑类、棘白菌素类、多烯类等，唑类药物通过抑制真菌细胞膜麦角甾醇生物合成起效，棘白菌素类药物通过抑制细胞壁葡聚糖合成关键酶达到抗真菌效果，以两性霉素B为代表的多烯类药物则与细胞膜麦角甾醇结合，形成细胞膜孔道使细胞外液内流，导致细胞肿胀死亡。但随着传统抗真菌药物的长期使用，临床出现越来越严重的菌株耐药。了解白念珠菌耐药机制对于药物研发有指导作用。本文就白念珠菌经典耐药途径和耐药机制研究进展进行简要阐述。

1 靶酶含量变化或结构变异

靶酶指的是药物发挥作用过程中结合的特定酶，其含量变化或结构变异均会影响白念珠菌的耐药性。唑类药物作用的靶酶为羊毛甾醇C14α-去甲基化酶，棘白菌素类药物作用的靶酶为β-1,3-葡聚糖合成酶。

麦角甾醇是维持细胞膜完整性的重要成分，羊毛甾醇14α-去甲基化酶是麦角甾醇合成的关键酶，其编码基因为ERG11。ERG11突变或过度表达对于唑类药物的耐药有重要影响。ERG11基因的错义突变在临床分离的耐药菌株中普遍存在[2]，常见的突变位点为R467K、Y132H、1471T、S405F和T315A，这些基因突变可单个或联合发生。近年来锌簇转录因子介导的耐药性研究越来越深入，Upc2p为调节ERG11基因表达的锌簇转录因子之一。Upc2p中A643V、G648D、G648S、Y642F等位点突变与ERG11基因过度表达有关，且功能获得性突变 (gain of function，GOF)在临床耐药株中普遍存在。相反的，有研究发现，UPC2基因GOF突变对于耐药性的形成作用微弱，其靶蛋白Mdr1p表达仅增加到敏感株的2.5倍[3]，在人工构建突变株中，ERG11基因的表达与UPC2无相关性。也有研究认为，ERG11过表达只是一种适应性改变，和耐药性无关联。由于ERG11过表达机制比较复杂，相信随着研究深入和更多调控基因和位点的发现，调节网络通路会更加完善。

由ERG3基因编码的甾醇△-5,6-去饱和酶 (sterol△5,6-desaturase)是麦角甾醇后期合成过程的关键酶，ERG3基因缺陷或无义突变可减少麦角甾醇的合成，但中间产物转变成的麦角甾-7,22-二烯醇 (ergosta-7,22-dienol)可部分代替麦角甾醇功能，白念珠菌不会因此死亡，反而导致耐药性的形成[4]。由此启发我们，未来研发抗真菌药物可从酶抑制剂入手，降低酶更新速率，抑制替代途径对菌株活性影响等。部分研究发现[5]，临床分离耐药菌株中无ERG3基因突变，因此对于ERG3基因突变与临床耐药的关系仍待进一步研究。

棘白菌素通过抑制β-1,3-葡聚糖合成酶来阻断真菌细胞壁葡聚糖的生物合成，造成细胞壁完整性缺陷。抗性表型通过细胞应激反应来实现，白念珠菌可通过转录因子调节各种应激反应过程。锌簇转录因子Cas5p是细胞壁应激反应的关键转录调节因子之一，由磷酸酶Glc7p激活，对于棘白菌素耐药性形成有重要作用。Cas5p纯合缺失降低了FKS1突变菌株的耐药性，使卡泊芬净最小抑菌浓度 (minimum inhibitory concentration,MIC)由30.72 ng/mL降低至3.84 ng/mL。这一点也暗示Cas5p是介导棘白菌素耐药性的关键调节因子，此外Cas5p也参与细胞周期调控[6]，有助于细胞有足够时间从环境应激中恢复。

2 外排泵活性增强

白念珠菌细胞膜存在外排泵，介导药物分子的外排。白念珠菌外排泵分两种：ATP能量依赖的转运蛋白超家族 (ATP-binding cassette transporter，ABC)和易化扩散载体蛋白超家族 (major facilitator superfamily，MFS)。

ABC转运蛋白的编码基因突变使外排泵活性增强。常见编码基因为CDR1～CDR10，其中CDR1与CDR2在调节耐药过程中发挥主要作用。Cdr1p，Cdr2p过度表达时念珠菌对唑类药物耐药，该过程中Cdr1p起主要作用。Tac1p为ABC转运蛋白关键调控因子，TAC1基因GOF突变可导致Cdr1p、Cdr2p过度表达[7]，共16个GOF突变位点分布在12个不同氨基酸，且这些氨基酸大多位于TAC1基因C-端。其中，R688Q位点突变仅导致Cdr2p表达上调[8]。

MFS为一类通过电化学势能被动运输的载体，介导疏水性药物排出。Mdr1p和Flu1p均为白念珠菌耐药相关的MFS蛋白。锌簇转录因子Mrr2p参与TAC1介导的耐药性，MRR2基因GOF突变包括S466L、T470N位点突变[9]。经证实Rep1p对于MDR1起负向调节作用，Mrr1p为正向调节作用，两者靶酶相同，但互不影响，可能Rep1p与Mrr1p作用于靶酶的不同部位。FLU1作用与CDR1类似，但其mRNA含量远低于后者，故由其介导的耐药性较弱。Cph1p作为MDR1特异性转录抑制子，起负向调控功能，其无义突变导致MDR1基因表达上调，并降低对氟康唑敏感性，但对于两性霉素B没有影响[10]，两性霉素B对突变株和敏感株均在0.125 mg/L时开始产生抑制作用。虽然有大量文献证实外排泵相关基因高表达与吡咯类药物耐药相关，但在女性生殖道感染临床分离株中CDR1、CDR2、MDR1基因表达并无显著性差异[11]。MDR1转录调控是顺式作用元件和反式调节因子共同作用的结果，具体机制仍未完全阐明。

3 钙调磷酸酶信号通路激活

钙调神经蛋白在白念珠菌中起毒力调控、反应应激等作用。钙调磷酸酶可作用于特定靶蛋白，Crz1p是目前已明确的唯一调控钙调磷酸酶的转录因子。外界环境应激会增加胞质钙浓度，激活钙调磷酸酶通路 (Calcium Cell Survival，CCS)。CCS途径即由白念珠菌Crz1p介导的钙依赖性转录途径，该途径受损会导致细胞对环境刺激敏感性提高，真菌存活能力下降。Crz1p虽然与压力应答有关，但Crz1基因缺失并不会导致真菌致死性损伤[12]，据此推测参与调节的其他关键蛋白仍未被发现或该调节通路可通过多种靶蛋白激活。白念珠菌基因组数据库表明RTA2基因编码一种具有7个跨膜结构域的膜蛋白，在耐药菌株中表达上调，参与钙调磷酸酶介导的耐药性形成。钙调磷酸酶也通过减少氟康唑对质膜的损伤而形成耐药性，为抗真菌治疗提供新靶点。

热休克蛋白Hsps存在于大多数生物体，可通过不同信号途径相互作用，调控白念珠菌生物活性、细胞周期、耐药性等。热休克蛋白90 (Hsp90)是一种高度保守的分子伴侣，在蛋白质的折叠、转运、成熟过程中起关键调节作用，为研究最为深入的Hsps之一。Hsp90参与白念珠菌对唑类和棘白菌素类药物耐药性的形成，该过程与钙调磷酸酶有关，钙调神经蛋白是依赖于Hsp90的耐药性形成关键蛋白。研究发现Hsp90抑制剂与氟康唑联合应用有助于提高对于耐药白念珠菌的疗效，联合应用时24 h菌群计数相对于氟康唑单用减少53%，且在人脐静脉内皮细胞中表现出低细胞毒性[13]，显示出治疗白念珠菌感染的临床应用前景。Hsp70在大多数哺乳动物中高度保守，生化特性相似，发挥双重作用。细胞表面Ssa1p与Ssa2p为Hsp70家族主要成员，一方面，Ssa1p、Ssa2p诱导细胞内吞作用，使白念珠菌毒力增强；另一方面，Ssa1p、Ssa2p与唾液组胺素Hst5p亲和力高，促进Hst5p进入细胞发挥抗真菌特性，减弱白念珠菌毒力。随着研究进展发现，Hsps参与调控MAPK通路，Ras1-cAMP-PKA信号通路和细胞周期信号通路等，这些通路对于白念珠菌活性和毒力形成有重要作用。未来抗真菌药更大可能性专注于联合治疗以提高疗效和延长耐受时间。

4 生物膜形成

随着人工器械和医疗技术的发展，形成生物被膜的白念珠菌更能有效抵御抗真菌药物。白念珠菌形成生物被膜后，氟康唑对其MIC值最高可上升几百倍。生物膜主要由细胞外基质包裹真菌细胞形成，黏附于生物或非生物表面，如植入装置，关节假肢，机械心脏瓣膜等。

Nobile等[14]最早发现HWP1基因缺失菌产生的生物膜量比野生菌株减少73.8%，且菌丝形成量也相对减少，这些证明HWP1为白念珠菌体内生物膜形成必需基因，同时HWP1基因表达受锌簇转录因子Bcr1p调控。生物膜可能通过抑制毒性物质大量释放，产生耐药性[15]，但Hsp90缺失会使生物膜耐药性丧失，细胞外基质中葡聚糖的含量也会变少。大量研究表明，完整菌丝形态发生途径对于积累生物膜量有至关重要的作用。念珠菌菌丝可表达多种黏附素，其黏附能力部分决定生物膜稳定性。凝集素样序列 (ALS)基因家族在生物膜早期形成和黏附过程中起重要作用[16]，转录因子Sfp1p负向调控ALS1，ALS3和HWP1，而转录因子Bcr1p和Efpg1p均为正向调控。甘油-3-磷酸酶合成基因 (RHR2)是生物膜调节基因之一，该调节过程与甘油合成改变有关，可能与甘油通过促分裂原活化蛋白激酶 (Hog1)途径维持细胞内渗透压有关。生物膜细胞基因表达与低氧环境下基因表达有明显相关性，缺乏完整生物膜的细胞对于低氧耐受性较差，据此推测，生物膜内细胞处于缺氧代谢状态。在营养物质消耗的培养基上生长的生物膜中，ICL1 (异柠檬酸裂合酶基因)和PCK1 (磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因)的乙醛酸和葡萄糖异生相关转录物增多，在抗真菌药物停止使用后，高度耐药细胞会重新填充生物膜，这对于真菌感染长期治疗造成很大阻力，是临床实际治疗中不可忽视的问题。生物膜的细胞异质性广泛存在，形成和调节机制复杂多样，仍有许多相关小分子作用机制不明，有望成为治疗的新靶点。

5 线粒体氧化呼吸抑制

近年来，本课题组研究[17-18]认为线粒体功能也参与白念珠菌耐药性的形成。由敏感亲本菌经氟康唑连续传代培养，直到60多代后获得耐药子代，通过蛋白质组学研究鉴定在菌株耐药性形成过程中发生改变的蛋白质，发现大多数差异蛋白涉及能量代谢，包括糖酵解 (Pgk1p)、发酵 (Adh1p)、三羧酸循环 (Idh1p)等。研究还证实，白念珠菌线粒体膜电位降低导致氧化磷酸化受阻，ATP水平下降，细胞内活性氧ROS水平下降，进而造成菌株对唑类药物耐受。进一步研究表明，线粒体Aox酶是替代途径 (抗氰呼吸)中减少性活性氧ROS的产生的关键酶，且该替代呼吸 (抗氰呼吸)途径会使白念珠菌对唑类敏感性降低，当用SHAM抑制Aox酶途径时，ROS产量增加，对唑类敏感性也得到恢复，但SHAM抑制剂临床意义仍待验证[19]。

6 其他途径

白念珠菌中存在四种MAPK途径：Hog途径、Mkc1途径、Cek1途径和Cek2途径。其中Hog途径参与适应外界氧化压力和渗透压力，对于其研究有助于新抗菌药物的研制。Hog-MAPK信号通路中，耐药株HOG1、SHP1、SSK1、PBS1基因mRNA表达量是敏感株两倍以上，且差异有统计学意义[20]。真菌细胞染色体发生丢失或增加，也可导致真菌耐药性变化。白念珠菌的8条染色体中R染色体的三倍体可促进菌株耐药性产生[21]。反转座子Zorro2可被咪康唑诱导激活并发生转座，进而参与白念珠菌对唑类药物的耐受[22]，过程可能与细胞内活性氧 (ROS)积累有关。

白念珠菌耐药性产生的机制复杂，尽管有研究表明一些化合物具有体外抗耐药真菌活性，但只是为药物开发提供了一些研究思路，距离进入临床应用还十分遥远。目前对耐药现象的防治主要从两方面着手：早期以预防为主，减少临床经验性用药；在治疗阶段，合理联合用药，控制抗真菌药的使用量，最大程度发挥药物作用，避免滥用，以达到最佳治疗效果。