猪流行性腹泻病毒感染猪小肠上皮细胞miRNA表达谱分析及验证

张宸语，陈佳宁，温建新，刘光亮

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州730046；2.青岛农业大学 动物医学院，山东 青岛266109)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由PED病毒(PEDV)引起的一种可以使仔猪发生急性腹泻、呕吐、脱水乃至死亡的病毒性传染病，对仔猪的病死率高达100 %，该病毒通常更易在寒冷的冬季传播和复制[1]，而针对PEDV并无有效的防治方法。miRNA是一种长度为22 nt左右的非编码单链小RNA，它可以参与细胞增殖与凋亡、免疫、组织器官的分化成熟、脂肪代谢、肿瘤形成及抑制等的转录后调控，能够以完全或者不完全的结合在靶mRNA上，进而抑制其翻译或降解mRNA本身，通过这种方式也可以抑制病毒的复制，宿主miRNA对病毒作用分为促进和抑制病毒的复制，而促进或抑制病毒复制又分为通过直接靶向病毒基因组和靶向细胞内源基因进而调控病毒复制两种方式[2-3]。miRNA与病毒存在多种多样的调控作用，但至今未见miRNA在PEDV中的研究，本研究建立了PEDV感染猪小肠上皮细胞(Intestine epithelial cells J2，IPEC-J2)后miRNA的表达谱并通过qPCR验证并测序，又进行GO(Gene ontology，GO)分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)代谢通路分析和差异表达分析，以期为研究miRNA对PEDV复制的影响提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系、病毒及主要试剂Vero E6细胞系、IPEC-J2细胞系、GFP-PEDV-N单克隆抗体(MAb)和PEDV LJX株均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室动物免疫遗传学培育团队保存；TransZol Up Plus RNA Kit、dNTP、TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Probe qPCR SuperMix、TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR Super-Mix、TransScript Probe One-Step qRT-PCR SuperMix均购自TransGen公司；X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent购自Roche公司；Insulin Transferrin Selenium-X Supplement(100X)、EGF、DMEM/F-12、Opti-MEM均购自Gibco公司M-MLV Reverse Transcriptase购自Promega公司。

1.2 miRNA mimic、引物及探针的合成 根据Hiseq测序结果，设计miRNA的qPCR上游引物(U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA)，PEDV检测引物及探针均根据PEDV LJX的M基因(EF185992)设计(PEDV-M F：CGTACAGGTAAGTCAATTAC/PEDVM R：CATAGAAAGCCCAACCAGTG；探针：TTC GTCACAGTCGC CAAGG，5'-FAM，3'-TAMRA)并由金为智测序公司合成；由差异表达分析结果筛选出差异性较大的两个miRNA，分别为novel-miR-877 mimic(UGUGUGUGUGGGCGCCGGACGCC)和sscmiR-219a(AGAGUUGAGUCUGGACGUCCCG)，由上海生工生物工程技术服务有限合成。

1.3 PEDV感染IPEC-J2免疫荧光验证及生长曲线绘制 培养IPEC-J2至70 %左右时，弃上清，PBS洗涤细胞3遍，按照以下分组处理细胞：将PEDV LJX株经无血清培养基稀释至MOI=1作为感染组，以同样稀释的无血清培养基作为对照组。对照组仅添加无血清培养基稀释液。各组37℃培养1 h后弃去上清，PBS洗涤3遍后更换含2.5 %胎牛血清的DMEM/F-12培养基，37℃培养，在12 h、24 h、36 h、48 h时取上清检测病毒TCID50，绘制病毒生长曲线，12 h时使用带GFP标签的PEDV-N蛋白MAb检测感染后绿色荧光的表达。

1.4 miRNA高通量测序及其差异分析、靶基因GO分析及KEGG代谢通路分析 按照TransZol Up Plus RNA Kit说明书提取感染组和对照组12 h，36 h的总RNA，由华大科技测序公司进行Hiseq高通量测序，获得小RNA的原始数据。对于测序结果中差异表达的miRNA，随机选择差异较大的16个miRNA进行qPCR验证。对测序所得miRNA进行差异分析，将显著差异表达的miRNA进行靶基因GO分析和KEGG代谢通路分析。

1.5 miRNA模拟物过表达对PEDV复制的影响由测序结果显示novel-miR-877和ssc-miR-219a在PEDV感染期间均显著差异表达，所以合成并分别转染novel-miR-877 mimic、ssc-miR-219a mimic或NC mimic至IPEC-J2，24 h后感染PEDV，在感染12 h、24 h、36 h、48 h收获细胞，提取总RNA并根据M-MLV Reverse Transcriptase反转录为cDNA，并使用探针法qPCR对PEDV-M进行绝对定量；收获细胞上清并使用TCID50测定miRNA过表达后对病毒滴度的影响。

2 结果

2.1 PEDV生长曲线绘制及miRNA测序结果差异性分析PEDV LJX株感染IPEC-J2 12 h时，病毒复制水平达到最高，之后迅速降低，该时间免疫荧光结果表明PEDV可以感染IPEC-J2(图1A)，感染36 h病毒复制能力降到最低，48 h时检测不到病毒滴度。结果表明PEDV感染IPEC-J2后存在两个不同时期的转折点，由此选择测序时间点PEDV感染为12 h和36 h的样品(图1B)。

图1 PEDV LJX感染IPEC-J2免疫荧光验证(A)及生长曲线绘制(B)Fig.1 Immunofluorescence assay(A)and the growth curve(B)of PEDV LJX strain in IPEC-J2

对感染组与对照组miRNA的长度进行比较，结果显示测序所得小RNA大部分处于20 nt～22 nt，表明大多数小RNA均为miRNA，且12 h、36 h感染组处于20 nt～22 nt的小RNA与对照组相比存在显著差异(p＜0.05)(图2)。而对感染组与对照组miRNA的表达进行差异性分析，即统计两个样品中表达的已知miRNA，判断该两组之间的表达量是否存在显著性差异，p＜0.05即为差异显著。结果显示，12 h感染组与对照组相比，存在15个显著差异的已知miRNA和146个未知miRNA，36 h感染组与对照组相比有包括ssc-miR-219a在内的13个已知miRNA和包括novel-miR-877在内的92个未知miRNA存在显著差异，而12 h和36 h的感染组相比，也有31个差异表达显著的已知miRNA和133个未知miRNA(表1)。随机挑选了16个miRNA验证其表达趋势，qPCR结果显示这些miRNA的表达趋势与测序结果基本一致，表明测序结果可信，同时，表明PEDV感染IPEC-J2可以有效改变其中miRNA的表达，miRNA确实参与了PEDV复制的调控。

表1 PEDV感染IPEC-J2后的miRNA差异表达结果Table 1 The differentially expressed miRNAs after PEDV infection

图2 小RNA长度分布Fig.2 The length distribution of the small RNAs

2.2 靶基因GO分析及KEGG代谢通路分析结果对12 h、36 h的感染组及对照组差异表达显著的miRNA(包括novel-miR-877和ssc-miR-219a在内的)进行GO及KEGG分析，GO分析结果显示，12 h、36 h感染组差异表达的miRNA主要参与生物调控、细胞过程、代谢过程等生物过程；细胞膜、细胞器等细胞成分；结合、分子转导活性、受体活性等分子功能的调控(图3A)。KEGG分析结果显示，差异表达的miRNA主要参与嗅觉转导、细胞因子-受体相互作用、Toll样受体信号通路、丙肝、麻疹、单纯疱疹病毒感染、JAK-STAT信号通路、RIG-I样受体信号通路、调节自噬、自身免疫性甲状腺疾病等通路的调节(图3B)。表明miRNA可能通过调节细胞的生物过程、细胞成分、分子功能及与抗病毒、免疫相关的信号通路进而影响病毒的复制。

图3 差异表达miRNA的GO分析(A)及KEGG分析(B)Fig.3 Analysis of GO(A)and KEGG(B)on the differential expression of the miRNAs

2.3 novel-miR-877和ssc-miR-219a过表达对PEDV复制的影响结果novel-miR-877是本研究首次发现的新miRNA，对其进行基因组定位，得到了其稳定的miRNA前体二级发夹结构(图4A)。novelmiR-877和ssc-miR-219a在IPEC-J2中过表达后，对PEDV的复制能力进行qPCR和TCID50检测，结果显示在感染12 h时，NC对照组的病毒M基因表达量、病毒滴度均显著高于novel-miR-877(图4B)和ssc-miR-219a(图4C)转染组，到36 h时趋于一致。表明novel-miR-877、ssc-miR-219a的过表达可在12 h时显著抑制PEDV在IPEC-J2中的复制。

图4 novel-miR-877的发夹结构(A)及novel-miR-877(B)、ssc-miR-219a(C)过表达对PEDV复制的影响Fig.4 Hairpin structures of novel-miR-877(A)and the effect of over expression of novel-miR-877(B)and ssc-miR-219a(C)on PEDV replication

3 讨论

在兽医上对miRNA表达差异研究较多的是针对猪繁殖与综合征病毒和为狂犬病毒等，对PEDV研究较少，本研究对PEDV侵入IPEC-J2后细胞miRNA表达谱的分析，首次发现了novel-miR-877，并对novel-miR-877、ssc-miR-219a在PEDV复制中的作用做了初步验证。

PEDV在全国范围内出现了大面积的暴发，对仔猪的致病率和致死率均很高，对养殖场造成严重的经济损失，但是目前并没有针对该病毒有效的防治手段。miRNA能够参与病毒的侵入和复制时的调控，但是有的宿主miRNA可以帮助病毒的复制和侵入，比如miR-27可以通过抑制SNAP25和TXN2的表达而抑制腺病毒的感染[4]；miR-22通过靶向宿主因子HO-1可以促进猪繁殖和呼吸综合征病毒的复制[5]；miR-21可以促进2型登革病毒在HepG2中的复制[6]；miR-4331可以通过靶向Rb1进而促进猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)介导的诱导的线粒体损伤，上调白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)的表达，还能体外激活p38 MAPK通路[7]。而至今未见miRNA在PEDV中的研究，PEDV在猪体内可以感染并引起IPEC-J2微丝骨架及其紧密连接的改变[8]，但是在该细胞中复制能力较差，其原因未见报道。IPEC-J2已经可以稳定传代，具有经济又方便的优点，所以选择IPEC-J2研究其编码的miRNA在病毒复制期间对病毒的作用。

一般来说，小RNA的长度区间为18 nt～30 nt，长度分布的峰值有助于判断sRNA的种类，如miRNA集中在21 nt或22 nt，siRNA集中在24 nt，piRNA集中在28 nt～30 nt[9]。本研究根据测序结果，将低质量，大于24 nt或小于18 nt的片段，污染的测序结果剔除掉，再将miRNA聚类分析后，并对miRNA进行差异分析和GO分析，找到有显著差异表达的与免疫相关的miRNA：let-7家族成员、miR-10、miR-106a、miR-126、miR-146、miR-150、miR-155、miR-17-3b、miR-17-5b、miR-181、miR-19、miR-19a、miR-20、miR-221、miR-424。根据这一现象可以推断，PEDV感染宿主IPEC-J2后，可能受到这些miRNA的调控而被抑制其在宿主体内的复制，还有可能利用这些miRNA逃避宿主免疫及抗病毒反应。GO分析结果显示，差异表达的miRNA可以调控结合、受体活性，表明PEDV可能通过改变miRNA的表达进而促进自身在IPEC-J2中的复制和感染能力。通过KEGG分析显示，miRNA可以参与JAK-STAT信号通路、Toll样受体信号通路的调节。JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节，而Toll样受体信号通路也与天然免疫有着密切的关系，由此可以判断宿主自身miRNA可以通过调节自身免疫能力进而影响病毒的侵入和复制能力。novel-miR-877是测序中发现的一个新的miRNA，在此之前并未被报导过，本研究发现其具有其抗病毒作用，对其进行靶基因预测，显示它有可能靶向TGFβ1、DDX3等与抗病毒有关的基因。ssc-miR-219a虽然早在猪脂肪组织、乳外泌体中被检测出[10-11]，但是其抗病毒作用也是首次在本研究中发现，这可能是通过直接靶向病毒基因组或作用于细胞其它基因进而抑制PEDV的复制，总之，本研究为miRNA在PEDV感染机制中作用的研究提供了实验依据。