细菌素产生菌的分离鉴定及细菌素生物学特性的初步研究

周 迪，杨旭夫，彭 凌

(韶关学院 粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心/中国农业科学院哈尔滨兽医研究所-韶关学院动物疫病诊断中心联合实验室，广东韶关512005)

近年来多重耐药菌株的出现引起了科研人员的广泛关注，寻求解决细菌耐药性的有效防治方法迫在眉睫。细菌素(Bacteriocin)是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类对它种细菌尤其是与产生菌亲缘关系密切的细菌种有抑杀作用的肽类或蛋白质类物质。细菌素产生菌对其自身产生的细菌素具有免疫力，这种免疫力通常是由伴随细菌素结构基因表达的免疫系统赋予的[1-2]。细菌素不仅多样性丰富，而且普遍认为其对真核细胞无毒副作用，由于其能被消化性蛋白酶消化，对肠道正常菌群也无影响[3]，因此其对人和动物是安全的。革兰氏阳性菌产生的多种细菌素均表现出相当广泛的抑杀菌活性，具有成为未来抗菌药物的潜能[4-5]。葡萄球菌素是葡萄球菌产生的细菌素的统称，国内外研究表明，葡萄球菌素在临床治疗和食品防腐方面均表现出潜在的应用价值。Jiang在评估高聚葡萄球菌素和顺铂液对心包积液肺癌患者的临床治疗效果时发现，心包腔内注射高聚葡萄球菌素和顺铂液是控制患者心包积液比较好的一种治疗方法[6]。Fontana等在研究由表皮葡萄球菌产生的葡萄球菌素Pep5和表皮素(Epidermin)对医用导管感染的表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌临床分离株抑制作用显示，2种葡萄球菌素不仅在浓度为640活力单位/mL能够抑制多个临床分离株，且能显著降低细菌对导管的粘附作用，从而为控制导管相关性感染提供了一种新策略[7]。牛莫拉克氏菌引起的犊牛传染性结膜炎是一种具有重大经济意义的疾病，用于预防该病的多种商品疫苗的效力均不理想，药物防治中耐药菌株的出现加重了对该病防治的困难。有研究表明，Bac1829、BacR1和金葡菌素A53能够抑制牛莫拉克氏菌，且Bac1829和BacR1对该菌的抑制作用尤为显著，因此这些葡萄球菌素为开发牛莫拉克氏病新的治疗药物提供了可能[2]。猪葡萄球菌产生的细菌素样活性物质4244，能够在一种食物内同时抑制食源性病原菌如单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌，提示其有开发成为食品防腐剂的潜能[1]。

本研究以粪纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)作为指示菌[8]测试分离菌株，获得多株能够产生抑杀该指示菌活性物质的菌株。同时测试活性物质产生菌株对不同动物细菌性病原菌的抑制作用，挑选2株对指示菌抑制作用明显且对红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)有较强抑杀作用的菌株作为研究对象，鉴定产生菌并初步研究其活性物质的生物学性质，为进一步筛选具有高效抑杀活性的细菌素及细菌素的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 指示菌及主要实验材料C.fimiNCTC7547株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；9型猪链球菌(SS9)、Ⅳ型胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌和红斑丹毒丝菌等菌株，均为本实验室分离鉴定并收藏；TSA和TSB培养基，为本实验室自制；各类细菌微量生化反应管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；DNA Marker、琼脂糖和蛋白酶K均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶(牛胰)和链霉蛋白酶购自广州齐云生物技术有限公司。

1.2 细菌样本的采集和分离培养 将TSA琼脂平板敞开置于韶关市某市场中心，放置5 min，收集空气样本；用棉拭子擦拭活鸡皮肤表面，或将鸡身上灰尘样品抖落于TSA平板表面；利用灭菌的棉拭子沾取新鲜宰杀鸡血液和活鱼体表，拭子样本分别涂布接种于TSA平板，37℃培养24 h，于实体显微镜下观察菌落形态。根据菌落的形态特征分别挑选单个菌落接种于TSA平板进行纯培养。

1.3 抗菌活性物质产生菌的筛选 以C.fimi作为指示菌，参照文献[9]采用延迟拮抗试验法检测分离菌株是否产生生物活性物质，通过测量菌落周围产生的抑菌圈大小来判断生物活性物质产生的强弱，每一试验至少重复3次。

1.4 抑菌活性物质产生菌对几种动物病原菌的抑制检测 在TSA固体培养基上分别均匀涂布接种SS9、Ⅳ型胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌和红斑丹毒丝菌，接种环沾取固体培养基上抑菌的活性物质产生菌新鲜培养物分别点接种于各培养平板，参照文献[2]，采用同时拮抗试验法检测抑菌活性物质产生菌对不同动物病原菌的抑制作用。

1.5 抑菌活性物质产生菌的鉴定 挑选对指示菌抑杀作用极显著且对病原菌有抑杀作用的产生菌，观察菌落形态结构，革兰氏染色后进行菌体形态学观察。参照《伯杰氏细菌学分类鉴定手册》进行生化试验。参照文献[10]进行16S rDNA序列鉴定并测序。

1.6 蛋白酶和NaOH对活性物质的影响 参照文献[9]方法，检测链霉蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和0.2 mol/L NaOH对抗菌活性物质活力的影响。

1.7 细菌培养上清液中细菌素的初提及活性分析将活性物质产生菌接种TSB培养液中，37℃128 r/min培养24 h。参照文献[11-12]，采用氯仿抽提法对培养上清液的抑菌活性物质进行初提。参照文献[13]，采用琼脂扩散法测定初提物活力，细菌素活力用AU(Arbitrary units)/mL表示，定义为测试样品对指示菌生长表现出清晰抑制作用最高稀释倍数的倒数，乘以细菌素单位体积(1 mL)与测试使用体积之比。

1.8 温度和pH对细菌素初提物的影响 将细菌素初提物在65℃、80℃、100℃和121℃分别处理15 min，检测细菌素初提物对温度的敏感性。同时将初提物各样本pH分别调至pH3.0、pH9.0和pH11.0，室温条件下感作4 h后，将样本pH调回至对照pH值，所有试验均用未经处理的细菌素初提物作为对照。采用琼脂扩散法测定处理前后样品的活性。

1.9 细菌素结构基因的PCR鉴定 设计鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)细菌素(即鸡皮素，gallidermin)特异性结构基因gdmH(ATP结合转运蛋白辅助因子编码基因)引物：(gdmF：5'-GAGCCTTGG TTTATCTTTGTTG-3'/gdmR：5'-TCTTTCGTCTTTAC CTTGTCCTC-3')，产物大小352 bp；利用文献[14]中表皮葡萄球菌产生的表皮素(Epidermin)特异性结构基因eipH的引物，参照文献[9]，提取细菌素产生菌细胞总DNA，以此为模板，利用上述两对引物分别进行PCR检测。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司广州分部测序。

2 结果

2.1 抗菌活性物质产生菌的筛选及活性物质对常见动物病原菌的抑制作用 通过延迟拮抗试验法，从纯化的细菌菌株中筛选得到48株对指示菌C.fimiNCTC7547株表现出抑制活性的菌株，检测结果显示抑菌圈直径为6 mm～50 mm，其中有2株抑菌圈直径≥40 mm，均分离自鸡身上的毛屑样本，编号分别为JC1和JC2。对6种常见动物细菌性病原菌的抑制试验结果显示，JC1和JC2对红斑丹毒丝菌抑菌圈直径为9 mm～10 mm，JC2对SS9抑菌圈直径达10.70 mm。表明这两株菌具有较强的抑菌活性。

2.2 活性物质产生菌的鉴定 对JC1和JC2分别进行菌落形态观察、革兰氏染色观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列鉴定。结果显示：JC1和JC2为黄色菌落，菌落边缘颜色较中间部分深，菌落不透明、表面干燥，呈扩散生长，边缘呈分枝状或锯齿状。革兰染色均为阳性，小球菌，多为单个存在。2个菌株的生化试验结果见表1。

表1 菌株JC1和JC2的生化特性Table 1 Biochemical properties of isolate JC1 and JC2

生化结果显示，JC1和JC2 2个菌株与鸡葡萄球菌的生化特性相符，且形态特征也与《伯杰氏细菌学分类鉴定手册》中描述的鸡葡萄球菌的形态特征一致。此外，对JC1和JC2的16S rDNA扩增、测序和比对分析表明，JC1和JC2与鸡葡萄球菌的相似性高达100 %，进一步确定两株菌株为鸡葡萄球菌。

2.3 固体培养基上蛋白酶和NaOH对活性物质的影响 采用延迟拮抗试验检测蛋白酶和NaOH对JC1和JC2产生的生物活性物质影响，结果显示2株菌产生的抗菌活性物质均能抵抗0.2 mol/L NaOH、蛋白酶K和胰蛋白酶的作用，作用前后抑菌圈大小无变化；对链霉蛋白酶的作用敏感，作用后抑菌圈基本消失。对NaOH的抵抗作用表明活性物质的抑菌作用不是由细菌代谢产生的有机酸导致的，对链霉蛋白酶敏感表明了两种活性物质的蛋白质属性(图1)。综上所述，表明该2株鸡葡萄球菌菌株产生的抗菌活性物质很可能是一种细菌素样物质[15]。

图1 固体培养基上3种蛋白酶和NaOH对JC1和JC2产生的活性物质的影响Fig.1 Effects of three enzymes and 0.2M NaOH on inhibition of isolate JC1 and JC2 on solid media

2.4 细菌素初提物的活性分析2株细菌培养上清初提物活性检测结果显示JC1和JC2对指示菌有明显抑制作用的最高稀释度分别为1∶256和1∶1 024，计算得到JC1和JC2细菌素初提物活力分别为5 120 AU/mL和20 480 AU/mL，初提的后细菌素活力均为未提上清原液活力的64倍(JC1未抽提上清细菌素活力为80 AU/mL，JC2为320 AU/mL)。表明氯仿抽提法适用于该类抗菌活性物质的抽提，且是一种相对简单的提取方法。

2.5 温度和pH对细菌素初提物的影响 温度试验结果显示，JC1和JC2细菌素初提物可抵抗65℃、80℃、100℃和pH3.0、pH9.0作用，作用前后抑菌圈大小无显著变化，活力未降低。但pH11.0作用使JC2初提物活力下降到320 AU/mL，而JC1无变化。121℃、15 min处理使JC1和JC2初提物活性分别下降至20 AU/mL和100 AU/mL(图2)。JC1和JC2细菌素初提物对热稳定性表明它们可能属于Ⅰ类细菌素羊毛硫细菌素类[2]。

图2 热处理和不同pH对JC1和JC2初提物活性的影响Fig.2 Effects of temperature and different pH on partial purifications of isolate JC1 and JC2

2.6 细菌素结构基因的PCR检测 以抽提的2株产生细菌素的菌株总DNA为模板，利用鸡皮素和表皮素结构基因gdmH和eipH特异性引物分别进行扩增。结果显示，2株菌用鸡葡萄球菌素结构基因gdmH特异性引物均能扩增得到与预期片段大小一致的DNA片段。PCR产物经测序、编缉后获得有效序列长度分别为353 bp和352 bp(图3)，BLAST在线比对分析显示，JC1和JC2有效片段与数据库中鸡皮素结构基因相似度分别达99 %和100 %，与表皮素结构基因相似度均为83 %；而以表皮素结构基因epiH特异性引物来扩增到目的条带。表明JC1和JC2产生的细菌素可能为鸡皮素。

图3 JC1和JC2细菌素结构基因的PCR检测Fig.3 Detection of structural genes of bacteriocins from isolate JC1 and JC2 by PCR

3 讨论

本研究从环境和动物体表取样，筛选到对指示菌C.fimiNCTC7543株有抑杀作用的菌株48株，其中2株对指示菌C.fimi的抑菌圈直径≥40 mm，编号分别为JC1和JC2。经生化鉴定和分子生物学鉴定，确定JC1和JC2为鸡葡萄球菌。通过对的细菌素结构基因的PCR检测和序列分析，表明了JC1和JC2产生的活性物质极有可能是鸡皮素。自Kellner等在1988年从鸡葡萄球菌(F16/P57)Tü3928菌株分离到鸡皮素以来[16]，不少研究者对鸡皮素和表皮素的结构基因、分泌特性、生物合成等进行了报道，证实鸡皮素是表皮素的天然变异体[2]。本研究选用的3种蛋白酶具有较广谱活性，链霉蛋白酶水解谷氨酸或天冬氨酸羧基端的肽键，胰蛋白酶是一种肽链内切酶，专门切割多肽链中赖氨酸或精氨酸残基中的羧基端肽键，蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶。Kellner[16]等和Allgaier[17]等对表皮素和鸡皮素结构研究显示，两种细菌素均存在胰蛋白酶和链霉蛋白酶的切割位点，且研究中均选用胰蛋白酶作为消化酶。本研究中2个菌株产生的生物活性物质对链霉蛋白酶敏感，与Allgaier等研究证实的链霉蛋白酶可成功裂解表皮素相符；但活性物质对胰蛋白酶不敏感，与Kellner等和Allgaier等研究结果不同，可能是JC1和JC2产生的细菌素在蛋白质结构上还有别于表皮素和Kellner等分离的鸡皮素。因此，有必要对JC1和JC2产生的细菌素进行纯化，并对蛋白质序列进行深入研究。实验中采用氯仿抽提法对JC1和JC2无细胞培养上清进行抽提，抽提后细菌素活力提高64倍，表明氯仿抽提法是该类细菌素抽提的适宜方法。

目前，具有潜在毒性化学成分的食品保藏方法越来越受到消费者的质疑，被认为是天然活性物质的细菌素的发现以及对细菌素应用方法的发展，使细菌素在食品保鲜上的应用成为可能。JC1和JC2初提物对热稳定和对低pH处理均能保持各自活力不变，提示鸡皮素具有应用于酸性食品防腐的潜能，但需要对引起食物腐败和食物中毒微生物的抑杀作用做进一步的研究。pH11.0作用使JC2初提物活力下降到320 AU/mL，仅为处理前初提物活力的1.6 %，表明JC2产生的鸡皮素在pH11.0条件下活性不稳定，与Allgaier等研究发现表皮素在高碱性条件下活力不稳定的结果一致[17]。JC1初提物活力在pH11.0作用后活力不变，两种鸡皮素对碱特性的差异可能是其蛋白质结构的不同造成的。2个菌株产生的鸡皮素对6种常见动物细菌性病原菌的抑制实验显示，JC1和JC2对红斑丹毒丝菌均有抑制作用，JC2还对SS9和变形杆菌有抑制，表明它们在防治某些特定细菌性疾病方面有潜在应用的可能。