沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达致死大肠杆菌的初探

王明晓，余子豪，刘金泽，李统战，张远星，余旭平

(浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州310058)

编码细菌鞭毛的基因簇位于细菌基因组的4个不同位置，包含50多个基因，至少由14个操纵子组成[1]。细菌鞭毛基因簇的表达呈现Ⅲ级阶梯(Three classes hierarchical order)[1-3]。研究表明，鞭毛表达的主调控基因flhDC(Flagellar master regulatory genes flhDC)控制其下游鞭毛基因的表达，调控表达强度，最终决定细菌表面的鞭毛长度、数量和运动力。flhDC主调控基因又受多种环境因子的调控，包括：环境温度、pH值、渗透压、氧气等[4]，使细菌更适应环境条件的变化，以逃离不利环境，获得更好的营养与生存条件。

大多数沙门氏菌有鞭毛，具有运动力，鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum，SP)和鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum，SG)除外。但Chaubal和Holt曾报道，SP在特定情况下存在鞭毛活性[5-6]。本实验室前期工作中探索SP的动力特性，将鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium，STM)542菌株的flhDC基因克隆于pMD18-T载体，转化入SP527和STM542中，结果发现flhDC基因正向转化子不容易筛选到，或即使筛选到相应克隆也不易转化入SP527和STM542中，推测克隆于pMD18-T载体中的flhDC基因由于lac启动子的漏表达，细胞中FlhD4C2的含量超过了细菌的耐受量，影响了细菌的正常生存，可能致死细菌。为了验证沙门氏菌flhDC基因过表达是否致死宿主菌，本实验研究了flhDC基因在超强调控能力的表达载体pN15E6中的克隆和过表达情况。

1 材料与方法

1.1 主要试剂NcoⅠ酶、BglⅡ酶、T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司；DL2000 Marker、DL5000 Marker、TaqDNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌质粒快速提取试剂盒和PCR清洁试剂盒、基因组快速抽提试剂盒均购自Axygen公司；IPTG和阿拉伯糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 质粒与菌株STM 542菌株购自中国兽医药品监察所；E.coliDH31soplacI菌株、pN15E6质粒由俄罗斯科学家Ravin NV[7]团队惠赠；E.coliJM109菌株、pBAD33质粒由本实验室保存；pKDb质粒、pBAD-flhDC重组质粒[8]由本实验构建保存。

1.3 目的基因的扩增及flhD、flhC同源性比较 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取STM542菌株基因组DNA，以其为模板，PCR扩增STM的flhDC及flhD、flhC基因片段。扩增所用引物及特性见表1，引物合成及PCR产物的测序由华大生物科技有限公司完成。

表1 目的基因及扩增引物Table 1 The primers for amplification of target genes

参照GenBank中5株肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)基因组序列：S.typhimuriumLT2、S.gallinarum287/91、伤寒沙门氏菌(S.typhi)CT18、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)B67、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)P125109；以及3株大肠杆菌(Escherichiacoli)基因组序列：MG1655、W3110、DH10B，分别比对5株沙门氏菌、3株大肠杆菌flhD、flhC推导氨基酸序列，计算其同源性。

1.4 含不同鞭毛基因的pN15E6重组质粒的构建及鉴定 用NcoⅠ/BglⅡ双酶切处理PCR目的基因片段和pN15E6质粒，将目的基因分别克隆于pN15E6中，构建重组表达质粒pN15E6-flhD、pN15E6-flhC、pN15E6-flhDC。以pN15-insChKUp3/pN15-insChKDn2为引物(表1)，PCR鉴定重组表达质粒。

1.5 pKDb-flhD重组质粒的构建及鉴定 以pN15E6-flhD重组质粒为模板，以Trrn_up1/T0_dn1为引物，PCR扩增flhD表达盒，克隆于经XcmⅠ酶切pKDb质粒，构建重组表达载体pKDb-flhD。以pKDb_SeqR/pKDb_SeqF为引物，PCR鉴定重组表达质粒。

1.6 鞭毛基因在大肠杆菌DH31soplacI、JM109中的过表达对菌株存活的影响 将含不同鞭毛基因的重组质粒(pN15E6-flhD、pN15E6-flhC、pN15E6-flhDC)转化DH31soplacI、JM109菌株，选取单克隆过夜培养，取无菌LB培养基106倍稀释过夜培养物，涂布于卡那氯霉素双抗性(或卡那抗性)LB琼脂平板和含0.4 mM IPTG的卡那氯霉素双抗性(或卡那抗性)的LB琼脂平板，37℃培养24 h，观察结果。

1.7 含pBAD-flhDC质粒的大肠杆菌JM109菌株动力试验的测定 分别将pBAD33、pBAD-flhDC重组质粒转化JM109菌株后，分别取2μL含pBAD33、pBAD-flhDC质粒的大肠杆菌JM109菌株的过夜培养物，点种于含不同浓度阿拉伯糖(0、0.005 %、0.025 %、0.125 %、0.5 %、1 %)的运动琼脂平板(不含相应的抗生素)，37℃培养6 h～7 h后，通过测量半固体平板上菌落的直径，评估沙门氏菌flhDC基因表达对大肠杆菌宿主菌生长、动力的影响。

2 结果

2.1 目的基因的扩增及flhD、flhC同源性比较 以STM542基因组为模板利用表1所示引物，PCR扩增获得基因片段大小分别为973 bp、579 bp、351 bp(图1)，经测序鉴定表明，分别为flhDC、flhC和flhD基因。

通过比对5株沙门氏菌、3株大肠杆菌flhD、flhC基因推导氨基酸序列，结果显示，5株肠炎沙门氏菌flhD的推导氨基酸序列完全相同，flhC的推导氨基酸同源性为98.96 %～99.83 %。3株大肠杆菌flhD、flhC的推导氨基酸同源性均在97 %以上。而沙门氏菌与大肠杆菌之间的flhD、flhC的推导氨基酸差异大一些，同源性分别为74.34 %～75.78 %，76.51 %～81.69 %。结果表明flhDC基因在沙门氏菌与大肠杆菌之间存在差异，需进一步验证沙门氏菌flhDC基因在大肠杆菌宿主菌中的调控功能。

图1 目的基因片段的PCR扩增Fig.1 Amplification of target genes by PCR

2.2 含不同鞭毛基因的pN15E6重组质粒的鉴定结果 以pN15-insChKUp3/pN15-insChKDn2为引物(表1)，PCR鉴定重组表达质粒pN15E6-flhD、pN15E6-flhC、pN15E6-flhDC。结果显示pN15E6-flhD、pN15E6-flhC、pN15E6-flhDC重组质粒均构建正确。

2.3 pKDb-flhD重组质粒的鉴定结果 以pKDb_SeqR/pKDb_SeqF为引物，PCR鉴定重组表达质粒pKDb-flhD。结果显示pKDb-flhD重组质粒构建正确。

2.4 鞭毛主调控基因flhDC过表达致死大肠杆菌宿主 将重组质粒pN15E6-flhDC转化DH31soplacI、JM109菌株后涂板培养，结果显示卡那氯霉素(或卡那)平板上有大量细菌生长，而对应含诱导剂的平板上无细菌生长(图2)，表明flhDC基因过表达能够致死大肠杆菌宿主菌。

图2 鞭毛基因flhDC过表达致死大肠杆菌宿主菌菌株的试验结果Fig.2 The overexpression of flagellar flhDC genes killed E.coli host strains

2.5flhD、flhC基因单独过表达不致死大肠杆菌宿主菌 将重组质粒pN15E6-flhD和pN15E6-flhC分别转化DH31soplacI、JM109菌株进行基因过表达试验，结果显示flhD和flhC单独过表达均不致死大肠杆菌宿主菌(图3)。结合结果2.2，表明flhDC基因过表达致死大肠杆菌宿主菌是由flhD和flhC两个基因共同表达(应该组合成FlhD4C2鞭毛主调控蛋白)引起的，而不是其中任何之一单独过表达的结果。

2.6 同一细胞中分别过表达flhD和flhC两个基因致死宿主菌 将重组质粒pKDb-flhD和pN15E6-flhC同时转化DH31soplacI、JM109菌株进行基因过表达试验，与flhDC双基因过表达致死宿主菌的结果一致，在同一细胞中同时过表达flhD和flhC也致死宿主菌。进一步证明了flhDC基因过表达致死大肠杆菌DH31soplacI和JM109是由flhD和flhC两个基因同时表达，并组合成了FlhD4C2鞭毛主调控蛋白所致，而不是其中任何之一单独过表达的结果。

2.7 含pBAD-flhDC质粒的重组大肠杆菌的动力试验 对含有pBAD33、pBAD-flhDC质粒的大肠杆菌JM109菌株进行动力试验测定，结果显示，与对照pBAD33相比，随着阿拉伯糖诱导浓度的提高，含沙门氏菌flhDC基因的重组菌株的动力不断增强，在阿拉伯糖诱导浓度为0.5 %的时候直径最大，随后在阿拉伯糖诱导浓度为1 %的时候，动力开始下降。表明沙门氏菌flhDC基因在低浓度阿拉伯糖诱导表达时可以促进大肠杆菌鞭毛动力，类似于大肠杆菌自身flhDC基因的活性。其中一次的动力试验结果如图4所示。

图4 含pBAD-flhDC质粒的大肠杆菌JM109菌株动力试验的测定结果Fig.4 The motility assay of E.coli JM109 contain plasmid pBAD or pBAD-flhDC

3 讨论

本研究首次发现了沙门氏菌flhDC基因过表达可以致死大肠杆菌宿主菌，并且结果显示只有flhD和flhC两个基因同时过表达才可以致死宿主菌，而单一基因过表达不会致死宿主菌。虽未见类似的过表达致死报道，但有研究结果显示，奇异变形杆菌flhDC表达量上升时，细菌出现生长抑制现象；而当flhDC表达量降低时，细菌又恢复到正常的生长状态[9]。表明，flhDC基因的表达量达到一定值时，细菌的生长受到抑制，而进一步过量表达时则致死细菌。

本研究通过比对flhD、flhC基因编码的氨基酸，发现其在沙门氏菌和大肠杆菌之间存在一定的差异。为探究沙门氏菌flhDC基因在大肠杆菌中的活性，本研究进行了flhDC重组菌的动力试验，结果显示，沙门氏菌flhDC基因在低浓度诱导表达时，具有促进大肠杆菌鞭毛动力的活性。且有研究报道，STM鞭毛基因fliC在大肠杆菌中可以表达并组装成鞭毛丝，也具有动力学特性[10]。表明，沙门氏菌的鞭毛基因，在大肠杆菌中也可正常表达，同样具有鞭毛活性。

细菌鞭毛基因的表达呈Ⅲ级调控，flhDC基因是Ⅰ级主调控因子，可开启Ⅱ级基因的表达和基体-鞭毛钩的组装，同时激活Ⅲ级基因表达所需的fliA基因的表达。此外，有研究表明flhDC基因除调控鞭毛基因的表达外，还参与调控mreB等非鞭毛基因的转录表达[11-12]，而mreB基因产物参与细菌生长与分裂。本研究结果显示的flhDC基因过表达致死宿主菌的现象，是否有可能通过调控mreB基因的过表达而实现；以及该现象是否是flhDC基因表达产物FlhD4C2首先通过调控宿主菌鞭毛的Ⅲ级表达系统，进一步通过被调控的鞭毛基因的表达产物，调控了鞭毛外与致死相关基因的结果；或者是FlhD4C2直接调控了鞭毛外与致死相关的基因，最终表现细菌死亡。有关其它鞭毛基因和鞭毛外基因过表达致死宿主菌的试验，本实验室正在进行中。

杀死或抑制细菌生长是人类控制细菌性疾病的主要策略，但随着抗菌药物的广泛使用，特别是大量滥用，细菌耐药性问题日益严重，因此急需寻找新型药物来控制细菌性疾病。本研究首次发现的flhDC基因过表达致死宿主菌的现象，以及通过对其机理的进一步深入研究，将有望发现一批与致死宿主细菌相关的基因，为新型药物的研发提供一系列新的靶点，为解决细菌耐药性问题提供新的方向。