荔枝核总黄酮对TGF-β1诱导人肝星状细胞凋亡的影响及机制

曹杰，林丽馨，覃桂金，肖绪华，霍群，赵永忠

(1桂林医学院附属医院，广西桂林541000；2广西壮族自治区南溪山医院；3桂林医学院)

肝纤维化(HF)的主要特征为细胞外基质(ECM)在肝内过度沉积，是一种常见的慢性组织损伤的细胞创伤愈合反应[1]。活化的肝星状细胞(HSC)是ECM的主要来源，在HF的发展过程中扮演重要角色。研究表明，HF处于动态变化过程中是可逆的[2]，故使活化及增殖的HSC被抑制并诱导其凋亡有望成为抗HF的有效方法[1]。Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路在HF过程中起重要作用，是肝细胞凋亡途径之一。目前常规西药对HF的治疗效果不理想[3]。抗纤维化的相关中药受到了广泛重视。荔枝盛产于两广地区，荔枝核中具有药理活性的主要物质之一为荔枝核总黄酮(TFL)。研究证明，TFL对胆汁淤积性大鼠有较好的抗纤维化效果，且可阻滞HSC增殖、诱导其凋亡，达到抗HF的效果[4～6]。2015年12月～2016年5月，本研究以人肝星状细胞(HSC-LX2)为研究对象，探讨TFL对活化的HSC-LX2凋亡的影响，进一步明确其干预HF进展的相关分子机制，为TFL的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 HSC-LX2(中美合资博慧斯生物医药科技有限公司)。TFL(南京泽朗医药科技有限公司，纯度 80%)。DMEM 高糖培养液(GIBCO公司)；胎牛血清FBS(GEMINI公司)；转化生长因子β1(TGF-β1,美国Peprotech公司)；TLR4单克隆抗体(Abcam公司)；NF-κB p65单克隆抗体(ProMab公司)；Anti白细胞介素1受体Ⅰ(IL-1RⅠ)多克隆抗体(Abcam公司)；β-Actin单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG 抗体(北京中杉金桥公司)；山羊抗兔IgG 抗体(北京中杉金桥公司)；流式凋亡试剂盒(美国BD公司)；流式周期试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)；Hoechst33258(碧云天公司)。流式细胞仪(美国BD 公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)，全自动凝胶成像分析系统(上海培清JS-780)，全自动化学发光图像分析系统(上海Tanon 5200)，倒置相差显微镜(德国蔡司)。

1.2 试剂配制 配制TGF-β1：用pH=3的柠檬酸钠试剂将TGF-β1粉末充分溶解，配制成168 ng/μL的母液，-20 ℃保存；取母液，配制成20 μg/L的储存液，4 ℃保存。配制TFL：用DMSO试剂将纯度80%的TFL充分溶解，将溶解的TFL溶于DMEM(含10%FBS及靑链霉素)中，配制成1 g/L的母液。将母液配制成实验所需的药物浓度，同时使各组中(除正常组外)TGF-β1的终浓度为5 μg/L[7]。

1.3 细胞培养 将细胞接种于含10% FBS的DMEM(含青霉素+链霉素)培养液中，于37 ℃、5% CO2及合适湿度的培养箱中培养。当细胞处于对数生长期时，用含EDTA的胰蛋白酶消化传代。将细胞随机分为正常组、TGF-β1组及150、300、600 mg/L TFL组。正常组常规培养；其他四组接种于含10% FBS的DMEM+5 μg/L TGF-β1、10 cm培养皿中，培养24 h后，150、300、600 mg/L TFL组分别加入150、300、600 mg/L TFL培养48 h[5]。

1.4 细胞形态学变化观察 采用Hoechst33258染色法。收集各组细胞，吸尽培养液，PBS洗2次，固定10 min，PBS洗2次；加Hoechst 33258染色液，避光染色5 min；PBS洗2次，封片。用倒置相差显微镜观察并拍照，实验重复3次。

1.5 细胞周期检测 采用流式细胞术。收集各组细胞，用含EDTA的胰酶进行消化，收集细胞于EP管中，PBS冲洗2 次，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，用PBS 1 mL 悬浮细胞，95%乙醇(4 mL)冰浴，4 ℃冰箱过夜。1 000 r/min 离心5 min，PBS 冲洗1次，每个样本加入400 μL PI染色液(1倍)，重悬细胞，37 ℃ 避光孵育30 min，上机检测各周期细胞比例。实验重复3次。

1.6 细胞凋亡检测 采用FITC Annexin V/PI双染色法。收集各组细胞，用不含EDTA的胰酶进行消化，收集细胞于EP管中，PBS冲洗2次，4 ℃离心机离心，2 000 r /min，10 min；弃上清液，加入Buffer缓冲液100 μL，混匀；避光加入FITC Annexin V 5 μL+PI 5 μL，室温避光孵育30 min，上机前加Buffer缓冲液200 μL，混匀，200～300目过滤，流式细胞仪检测细胞早期(细胞膜外翻)、晚期(细胞膜外翻，细胞释放其他物质)凋亡情况，计算细胞凋亡率。实验重复3次。

1.7 细胞内TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集各组细胞，用胰蛋白酶进行消化，收集细胞于EP管，PBS清洗3遍，1 000 r/min离心，离心3次，每次5 min，加入足量蛋白裂解液，冰上充分裂解，4 ℃，15 000 r/min离心后，上清液即为所提蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法转膜，BSA封闭，孵育一抗，孵育二抗，发光显色，实验重复3次。蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 各组细胞形态学变化比较 TGF-β1组细胞增殖活跃，呈聚集状，胞体增大，胞突伸展、延长，数量明显增加。正常组、TGF-β1组细胞核形态完整；150、300、600 mg/L TFL组可见细胞核固缩、裂解、凋亡小体形成等细胞凋亡形态学变化，并随TFL浓度的升高，细胞数量减少，凋亡细胞增多。

2.2 TFL对HSC-LX2周期的影响 随TFL浓度升高，TFL组G0/G1期细胞增多(P<0.05)，S期细胞减少(P<0.05)。见表1。

表1 各组不同周期细胞分布比较

注：与TGF-β1组比较，*P<0.05；与150 mg/L TFL组比较，△P<0.05；与300 mg/L TFL组比较，▲P<0.05。

2.3 TFL对HSC-LX2凋亡的影响 随TFL浓度的升高，TFL对HSC-LX2细胞凋亡促进作用增强，更倾向于促进细胞晚期凋亡。见表2。

表2 各组细胞凋亡率比较

注：与TGF-β1组比较，*P<0.05；与150 mg/L TFL组比较，△P<0.05；与300 mg/L TFL组比较，▲P<0.05。

2.4 TFL对HSC-LX2内TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白表达的影响 150、300、600 mg/L TFL组TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白表达量低于TGF-β1组(P均<0.05)，且随TFL浓度升高，HSC-LX2内TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白表达量逐渐降低(P均<0.05)。见表3。

表3 各组TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白相对表达量比较

注：与TGF-β1组比较，*P<0.05；与150 mg/L TFL组比较，△P<0.05；与300 mg/L TFL组比较，▲P<0.05。

3 讨论

HF是各种因素引起的病理性慢性炎症修复反应。当肝细胞损伤时，促发炎症反应，分泌大量细胞因子和化学介质，共同作用于HSC，使HSC发生活化，合成大量ECM，沉积于肝内，导致HF的发生发展[8]。伴随细胞因子与相应受体结合的HSC活化与增殖，是HF的关键环节。

细胞周期可分为四个阶段：G0/G1期即DNA合成前期，为DNA合成做准备；S期即DNA合成期；G2期即DNA合成后期；M期又称D期即有丝分裂期。HSC-LX2细经TGF-β1活化后，可见细胞胞体增大，胞突伸展、延长，且数量明显增加，呈增殖状态。流式细胞术检测显示，TFL作用于增殖的HSC-LX2，使HSC-LX2阻滞于G0/G1期，不能为DNA合成准备原料，DNA无法合成，致使细胞增殖分裂无法进行，细胞周期被阻滞。细胞凋亡是主动进行的，是由基因调控的程序性死亡，在生物体的生长发育、各种疾病的发生发展过程中都发挥重要作用。结果显示，TFL作用于增殖的HSC-LX2后，可见细胞核固缩、裂解、凋亡小体形成等，呈现凋亡形态学变化，且随着药物组浓度的增大，细胞数量减少，凋亡比例增加。同时TFL对HSC-LX2凋亡具有促进作用，且更倾向于促进细胞晚期凋亡，达到抗HF的效果。然而，其分子机制仍不明确，仍需进一步明确其可能存在的关系。

TLR是先天免疫识别受体，在人体内具有重要作用，其与炎症反应及纤维化形成过程中的信号传递关系紧密。TLR4在多种细胞上表达，其中包括HSC；不管是静止的HSC还是活化的HSC，均表达TLR4。TLR4的完整信号转导通路存在于活化的HSC中。TLR4激活后通过信号转导使下游的核心因子NF-κB激活，活化的NF-κB进人细胞核进行转录调控，诱导细胞凋亡[9]。NF-κB具有多向性调节作用，参与调控多种因子的表达，在免疫调控、炎症、应激反应及细胞凋亡中发挥重要作用[10]。活化的NF-κB调控炎性因子的表达，大量炎性介质被释放，引起肝脏损害[11]。本研究结果显示，TGF-β1激活后的HSC-LX2，经TFL干预后，细胞内TLR4、NF-κB蛋白表达降低。韦铮武等[12]研究表明，TFL可通过降低TLR4、NF-κB在活化的HSC-T6中的表达，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，减轻HF。因此，推测TFL诱导活化的HSC-LX2凋亡的分子机制可能与降低TLR4、NF-κB的表达相关，从而达到抗纤维化的效果。

IL-1为重要的免疫和炎性反应调节因子，有研究显示，IL-1在炎性致病机制中起决定作用；而IL-1存在于大多数体内细胞，当发生炎症反应时，IL-1可迅速发生作用[13]。IL-1可促进HSC活化、增生及抑制ECM的降解[14]。当肝细胞损伤时，IL-1可以加重肝脏损伤[15]。研究发现，IL-1是NF-κB信号通路最重要的炎症细胞因子，通过与跨膜受体IL-1受体(IL-1R)结合后激活下游信号通路，在HF发生发展中起重要作用[16]。当致炎因子作用于机体时，IL-1与相应受体结合，传导生物学信号，发挥生物学效应。IL-1受体家族包括IL-1RⅠ和IL-1RⅡ。目前认为IL-1RⅠ是IL-1的主要受体。TLR细胞内区域的其中约200个氨基酸与IL-1RⅠ及其他数种植物疾病抵抗蛋白具有高度的同源性，称TIR[17]。TLR和IL-1R构成的系统TLR-IL-1R是炎性反应时机体产生免疫应答和炎症反应的关键信号系统。有研究表明，大黄和丹参通过弱化TLR-IL-1R信号通路的作用，控制急性胰腺炎炎症的放大过程[18]。本研究结果表明，各浓度TFL组TLR4、IL-1RⅠ蛋白表达降低，且呈浓度依赖性，随TFL浓度升高，TLR4、IL-1RⅠ蛋白表达逐渐减低。因此，推测TLR-IL-1R炎症通路可能参与了HF的过程，但其具体分子机制尚待进一步研究。因此，通过抑制TLR-IL-1R炎症通路，有望成为抗HF的一条新途径。

总之，导致HF发生发展的信号传导通路众多，且通路之间相互交叉，细胞及动物实验目前尚不能明确其具体机制，仍需进一步研究证实。

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