ONECUT1重组质粒构建及其对细胞应激相关基因表达的影响

余绪明，余世荣，张晓燕，石金敏，王佳

(湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000)

同源域蛋白在细胞分化和胚胎发育中起关键作用[1]。Cut同源域蛋白是一个特殊的且由两部分组成的DNA结合同源蛋白。Cut同源域蛋白根据Cut重复单元分为几个亚族[2]。ONECUT属于Cut同源域蛋白家族的一类转录因子，包含1个Cut域和1个同源域。Cut域主要由70个氨基酸组成，主要负责DNA结合[3]。ONECUT1是ONECUT亚家族中重要成员之一，其作为转录因子调控关键靶基因的表达，此外还调节复杂的信号网络并介导复杂的生物学进程[4]。机体内氧化应激失衡导致活性氧(ROS)过度产生，进而引起组织损伤。此外，氧化应激失衡也是某些疾病发生的诱因之一[5]。研究发现，ONECUT1可能是线粒体抗氧化酶系统若干基因的上游调控基因，在调节线粒体抗氧化应激反应中可能发挥关键作用。但ONECUT1与应激之间的相关性尚缺乏系统研究。为进一步探究其生物学功能，2017年3～7月，本研究构建了人源ONECUT1-pcDNA3.1(-)表达质粒，并转染U251细胞，检测细胞应激相关基因的表达，以期为阐明ONECUT1与抗氧化应激基因、内质网应激基因的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂来源 U251细胞由武汉大学基础医学院汪晖教授实验室提供；AxyPrep质粒DNA小剂量试剂盒购自AxyGEN；FBS购自杭州四季青公司；DMEM购自武汉启动子生物公司；Penicillin-Streptomycin Solution, 100X购自CORNING；opti-MEM培养基购自Gibco；Lipofectamine 2000购自Invitrogen；TRIzol购自TAKARA；DH5α感受态购自TIANGEN；yeast extrac、Tryptone购自Invitrogen；Ampicillin soidium购自AMRESCO；T4DNA连接酶、EcoRⅠ、HindⅢ购自Invitrogen公司；pcDNA3.1(-)购自湖南优宝生物公司；DNA Ladder购自碧云天生物公司；Agarose购自Sigma；SYBR Premix EX Taq购自TAKARA；I-5TM 2X Hi Fidelity Master Mix购自Molecular Cloning Laboratones；All-in-one cDNA Synthesis SuperMix购自Biotool；GoldViewⅡ型核酸染色剂购自Solarbio；胶回收试剂盒购自BiomiGA。

1.2 U251细胞培养 自液氮罐中取出U251细胞，迅速置于37 ℃水浴中解冻1～2 min，加入含10% FBS、1%双抗培养液10 mL，1 500 r/min离心5 min弃培养基，将细胞接种于培养瓶，于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养24 h，当细胞呈单层致密状分布时，PBS洗1～2遍，0.25%胰蛋白酶消化后按1∶3传代，传至第2代用于实验。

1.3 h-ONECUT1质粒构建 根据NCBI给出的ONECUT1 mRNA参考序列(NM_004498.3)设计构建PCR扩增的上下游引物，即上游引物序列为AATGGAATTCATGAACGCGCAGCTGACCATGG (内切酶为EcoRⅠ)，下游序列为GGCGAAGCTTTCATGCTTTGGTACAAGTGCTTG(内切酶为HindⅢ)。提取U251细胞总RNA，取1 μg总RNA，加入All-in-one cDNA Synthesis SuperMix 10 μL，RT-PCR扩增获得cDNA样本，扩增条件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA样本为模板，用构建的上下游引物RT-PCR扩增ONECUT1全部CDS序列。构建体系：cDNA模板3 μL、Froward primer 2 μL、Reverse primer 2 μL、I-5TM， 2×High Fidelity Master Mix 25 μL，ddH2O 18 μL；条件：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳，目的基因切胶回收并用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切产物纯化回收后T4DNA连接酶连接过夜，DH5α感受态进行转化，AMP板子上挑选单克隆并摇菌扩增，提取质粒，重组质粒进行双酶切、RT-PCR鉴定，并进行测序。

1.4 h-ONECUT1质粒转染 将U251细胞接种于6孔板，约(1～2)×105/孔，于37 ℃、5% CO2培养箱培养，待细胞长至40%～60%时进行转染。按照Lipo2000转染说明书进行操作。体外采用opti-MEI优化培养基分别稀释重组h-ONECUT1-pcDNA3.1(-)质粒和pcDNA3.1(-)质粒各4 μg作为A液，将Lipo2000 10 μL加入opti-MEI优化培养基250 μL中作为B液，均室温放置5 min，将A液加入B液混匀，室温放置20 min，即体外重组质粒包装完成。将包装好的重组质粒(转染组)及空载质粒(空载组)分别加入6孔培养板，培养6 h，更换完全培养基继续培养24 h。qRT-PCR法检测显示，U251细胞内ONECUT1升高，转染成功。

1.5 U251细胞ONECUT1、线粒体抗氧化应激相关基因、内质网应激相关基因表达检测 采用qRT-PCR法。转染24 h收集细胞，TRIzol提取总RNA，反转成cDNA样本，-20 ℃保存备用。qRT-PCR检测h-ONECUT1；线粒体抗氧化应激相关基因包括SOD1、CAT、GPX1、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、NRF2、KEAP1、PARK7；内质网应激相关基因包括MANF、PERK、IRE1α和ATF6。引物由武汉擎科生物公司合成，引物序列：ONECUT1上游引物5′AGCGTCGAACTCTACATGCAA3′，下游引物5′TGCTTTGGTACAAGTGCTTGAT3′；Nqo1上游引物5′GAAGAGCACTGATCGTACTGGC3′，下游引物5′GGATACTGAAAGTTCGCAGGG3′；GcLm上游引物5′CATTTACAGCCTTACTGGGAGG3′，下游引物5′ATGCAGTCAAATCTGGTGGCA3′； prdx1上游引物5′CCACGGAGATCATTGCTTTCA3′，下游引物5′AGGTGTATTGACCCATGCTAGAT3′；GcLc上游引物5′GGAGACCAGAGTATGGGAGTT3′，下游引物5′CCGGCGTTTTCGCATGTTG3′；sirt1上游引物5′TGTGTCATAGGTTAGGTGGTGA3′，下游引物5′AGCCAATTCTTTTTGTGTTCGTG3′；CAT上游引物5′CTTCTCCAGTGGCCAGACATG3′，下游引物5′GTCATCAGGGCAAACCTCCTT3′；GPX1上游引物5′TGACTCTACCCACGGCAAGTTCAA3′，下游引物5′ACGACATACTCAGCACCAGCATCA3′；SOD1上游引物5′GAAGAGGTTCTGTGGGGTTT3′，下游引物5′CCTGACTGATATATGTGGCTC3′；NRF2上游引物5′TCCAGTCAGAAACCAGTGGAT3′，下游引物5′GAATGTCTGCGCCAAAAGCTG3′；KEAP1上游引物5′GTGTCCATTGAGGGTATCCACC3′，下游引物5′GCTCAGCGAAGTTGGCGAT3′；PARK7上游引物5′AACCGGAAGGGCCTGATAG3′，下游引物5′GCAAGAGGGTGTGTTGTAACT3′；MANF上游引物5′GCTACTATATCGGGGCCACAG3′，下游引物5′CTTCTTCAGGTCCACTGTGCT3′；PERK上游引物5′GGAAACGAGAGCCGGATTTATT3′，下游引物5′ACTATGTCCATTATGGCAGCTTC3′；IRE1α上游引物5′AGAGAAGCAGCAGACTTTGTC3′，下游引物5′GTTTTGGTGTCGTACATGGTGA3′；ATF6上游引物5′TCCTCGGTCAGTGGACTCTTA3′，下游引物5′CTTGGGCTGAATTGAAGGTTTTG3′；GAPDH上游引物5′CATCACCATCTTCCAGGAGCGAGA3′，下游引物5′TGCAGGAGGCATTGCTGATGATCT3′。扩增体系：Template 2 μL，SYBR Green Mix 5 μL，primer F 0.3 μL，primer R 0.3 μL，dd H2O 2.4 μL；条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 h-ONECUT1质粒构建结果 1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在DNA Marker 1 000～1 500 bp出现单带，即为插入的全部CDS序列，1 398 bp。测序证实质粒构建成功。

2.2 两组细胞内线粒体抗氧化应激相关基因、内质网应激相关基因表达比较 与空载组比较，转染组线粒体抗氧化应激相关基因CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7表达上调(P均<0.05)，SOD1、GPX1、NRF2、KEAP1表达差异无统计学意义(P均>0.05)。与空载组比较，转染组内质网应激相关基因MANF、IRE1α、PERK、ATF6表达差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1、2。

表1 两组线粒体抗氧化应激相关基因表达比较

表2 两组内质网应激相关基因表达比较

3 讨论

ONECUT家族包含哺乳动物肝核因子6(HNF6)[6]、人源OC-2[7]、果蝇D-onecut[8]及海鞘类HrHNF-6[9]。人源ONECUT1主要位于15号染色体上，具有6个外显子，编码含有465个残基的蛋白；其大多分布于肝脏、大脑、皮肤组织中[10]，在脑中表达存在区域特异性;进一步研究发现，其利用双向ONECUT同源域序列将蛋白定位于核腔室，并与许多靶基因启动子的特异性DNA序列结合，进而调控靶基因的表达[4]。本研究探讨了ONECUT1与应激之间的相关性，利用重组DNA技术成功敲高U251细胞内ONECUT1。SOD1、CAT、GPX1、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、NRF2、KEAP1、PARK7是体内抗氧化酶系统重要的代表性基因，重要功能之一是维持机体内线粒体氧化应激稳态[11]。CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7可能是ONECUT1的下游靶基因。ONECUT1可能具有抗线粒体氧化应激的功能。MANF是进化上高度保守的分泌型分子，大多数位于内质网腔。MANF是内质网应激反应蛋白，可快速分泌并保护细胞免受内质网应激诱导的死亡。PERK、IRE1α、ATF6均是内质网跨膜敏感蛋白，参与非折叠蛋白反应；在正常细胞中，三者通过结合内质网主要伴侣分子GRP78/Bip，维持着失活状态。当内质网应激时，GRP78从敏感蛋白中分离，随后三者被活化。本研究转染后U251细胞内线粒体抗氧化应激相关基因CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7表达上调，SOD1、GPX1、NRF2、KEAP1表达无变化。内质网应激相关基因MANF、IRE1α、PERK、ATF6表达无变化。提示ONECUT1可能是抗线粒体氧化应激基因，在调节线粒体氧化应激稳态中可能发挥关键作用；ONECUT1与内质网应激无关，ONECUT1在体内可能不参与内质网应激反应[12]。

本课题组后续研究拟采用RNAi干扰技术，敲低U251细胞内ONECUT1，检测细胞内CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7的表达。以期进一步阐明ONECUT1的抗线粒体氧化应激的生物学功能。

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