甲泼尼龙预处理对大鼠机械通气相关性肺损伤的影响及机制

瞿敏，茅顺洪，缴宝杰，史丹丹，刘香阁，杨强，马志红，李慧智

(1沧州市中心医院，河北沧州 061001；2沧州市人民医院；3泊头市医院)

机械通气可加重已有的肺损伤或引起急性肺损伤，称为机械通气相关性肺损伤[1]，该类肺损伤常伴有严重的细胞凋亡[2]。唯BH3域蛋白BID、BIM和PUMA是Bcl-2家族重要的促凋亡因子，在细胞凋亡中起重要作用[3]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一，在肺组织中主要表达于肺泡上皮细胞及血管内皮细胞。研究[3]表明，JNK信号通路参与了机械通气相关性肺损伤的发生[4]。甲泼尼龙属中效糖皮质激素，有稳定细胞膜、抗炎和非特异性免疫抑制作用，能有效消除肺间质水肿，减轻肺组织细胞凋亡[5]。本研究通过制备大鼠大潮气量机械通气急性肺损伤模型，观察甲泼尼龙预处理对大鼠肺的保护作用，并探讨其机制，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂、仪器 甲泼尼龙(意大利Pfizer Manufacturing Belgium NV公司)，免疫组化测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，酶联免疫试剂盒(美国R&D公司)，Bradford蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)。逆转录试剂盒和PCR试剂盒(美国Fermentas Life Science公司)，JNK、p-JNK、BID、BIM、PUMA、Caspase-3一抗(美国Santa Cruz公司)，二抗山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物科技有限公司)，TUNEL凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)。SAR-1000型小动物呼吸机(美国Harvard Apparatus公司)，Reveal型Imager图像分析仪(美国Bio-Rad公司)，i-STAT1型血气分析仪(美国雅培公司)。

1.2 实验动物来源、分组及处理 SPF级雄性SD大鼠100只，体质量270～320 g，购自河北省实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK(冀)2013-0002，批号：38000800000421。于恒温环境中饲养，自由饮水和进食，所有动物均按照实验动物管理和使用指南进行饲养和处理。实验经沧州市中心医院实验动物伦理委员会核实批准。采用随机数字表法将100只大鼠分为C组、V组、Mp1组、Mp2组、Mp3组，各20只，实验过程中出现3只(V组2只，Mp1组1只)大鼠死亡，均排除出本研究，及时补充3只大鼠至每组20只。C组不行机械通气，自主呼吸空气4 h；V组、Mp1组、Mp2组、Mp3组机械通气4 h，机械通气前20 min后三组分别静脉输注甲泼尼龙2、10、30 mg/kg，V组静脉输注等容量生理盐水。

1.3 机械通气相关性肺损伤模型制备 本研究参照文献[6]介绍的方法和预实验结果制备大鼠机械通气相关性肺损伤模型。所有大鼠实验前禁夜食12 h，自由饮水，腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉下气管切开，插入气管导管并固定，股动脉插管用于监测动脉压和采血，股静脉插管建立液体通道，麻醉维持采用静脉输注戊巴比妥钠2 mg/(kg·h)。V组、Mp1组、Mp2组、Mp3组大鼠接小动物呼吸机行机械通气，呼吸机参数设置：潮气量为40 mL/kg，呼吸频率为50次/min，吸呼比为1∶1，呼气末正压为0，吸入氧浓度为21%。通气过程中保持仰卧位，实验过程中维持室温为26～28 ℃。

1.4 观察指标

1.4.1 氧合指数(OI) 于插管即刻(T1)及机械通气1、2、4 h(T2～4)时采集各组大鼠股动脉血样，进行动脉血气分析，记录PaO2，计算OI。OI=PaO2/FiO2。

1.4.2 肺通透指数(LPI)与肺湿/干重(W/D) T4时，取各组大鼠股动脉血样2 mL于干燥试管中，4 ℃下3 000 r/min(离心半径7.7 cm)离心10 min，分离血清，采用全自动生化分析仪测定血浆蛋白浓度。取血后按照实验动物伦理学要求经动脉放血处死大鼠，立即开胸分离两侧肺组织，结扎右主支气管，采用5 mL预冷的PBS分3次灌洗左肺，回收肺泡支气管灌洗液，于4 ℃下3 000 r/min离心10 min，离心半径16 cm，取上清液，-80 ℃保存。采用考马斯亮蓝法检测肺泡支气管灌洗液中蛋白含量。LPI=支气管肺泡灌洗液蛋白浓度/血浆蛋白浓度。取左肺下叶称肺湿重，然后置于70 ℃干燥箱中烤至恒重后称干重，计算W/D。

1.4.3 肺组织病理学改变及肺泡损伤率(IAR) 取各组大鼠右肺下叶组织，经10%中性甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下(×200)观察肺组织病理学结果。光镜下连续观察200个肺泡，计数含红细胞和白细胞超过2个以上的肺泡(视为损伤肺泡)数，计算IAR，即损伤肺泡计数占总肺泡计数的百分比。

1.4.4 肺组织细胞凋亡指数(AI) 采用TUNEL法。光镜下随机选取各组大鼠肺泡区10个完整而不重叠的高倍视野(×400)，观察细胞凋亡情况，计算AI，AI=凋亡阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.4.5 肺组织JNK mRNA表达 采用RT-PCR法。取各组大鼠右肺上叶新鲜肺组织100 mg，采用TRIzol法提取总RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆转录试剂盒说明进行操作。采用primer5．0软件设计内参β-actin及JNK引物。PCR反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35个循环后72 ℃、10 min。4 ℃终止反应。取PCR反应产物10 μL，行琼脂糖凝胶电泳，采用Imager图像分析仪测定各条带吸光度值，以JNK吸光度值与β-actin吸光度值之比代表JNK mRNA的相对表达量。

1.4.6 JNK、磷酸化JNK(p-JNK)、唯BH3结构域蛋白(BID、BIM、PUMA)、Caspase-3蛋白表达 采用Western blotting法。取各组大鼠右肺上叶组织，BCA标准曲线法测定蛋白浓度，采用蛋白抽提试剂提取蛋白。取40 μg蛋白上样经12% SDS-PAGE凝胶电泳后转至硝酸纤维膜，以兔抗大鼠p-JNK一抗(1∶500)、JNK一抗(1∶500)、BID一抗(1∶2 000)、BIM一抗(1∶2 000)、PUMA一抗(1∶2 000)、Caspase-3一抗(1∶2 000)、β-actin一抗(1∶500)孵育后，4 ℃过夜。次日洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶500)，室温孵育1.5 h，再次洗膜后置于NBT/BCIP显色液避光显色，扫描蛋白印记图，采用Imager图像分析系统进行半定量分析，以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值反应目的蛋白表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠各时点OI比较 见表1。

表1 各组大鼠各时点OI比较

注：与本组T1时相比，*P<0.05；与C组同时点相比，#P<0.05；与V组同时点相比，△P<0.05。

2.2 各组大鼠肺组织病理学观察结果及LPI、W/D、IAR、AI比较 光镜下C组肺组织形态完整，肺泡形态正常，肺间质未见增厚水肿，肺泡腔无渗出及出血，罕见中性粒细胞。V组与Mp1组肺组织结构明显破坏，肺泡间隔明显增厚，肺间质水肿，肺泡内出血，肺泡萎陷，大量炎性细胞浸润。Mp2、Mp3组较V组病理损伤减轻，肺泡间隔轻微增厚，肺泡形态正常，肺泡腔无明显渗出及出血，肺间质水肿，罕见中性粒细胞。各组大鼠LPI、W/D、IAR、AI比较见表2。

表2 各组大鼠LPI、W/D、IAR、AI比较

注：与C组相比，*P<0.05；与V组相比，#P<0.05。

2.3 各组大鼠肺组织JNK、p-JNK蛋白及JNK mRNA表达比较 见表3。

表3 各组大鼠肺组织JNK、p-JNK蛋白及JNK mRNA表达比较

注：与C组相比，*P<0.05；与V组相比，#P<0.05。

2.4 各组大鼠肺组织BID、BIM、PUMA、Caspase-3表达比较 见表4。

表4 各组大鼠肺组织BID、BIM、PUMA、Caspase-3表达比较

注：与C组相比，*P<0.05；与V组相比，#P<0.05。

3 讨论

本研究结果显示，大潮气量机械通气4 h时，与C组比较，V组大鼠OI明显下降，W/D、LPI、IAR、AI均明显升高，在光镜下肺组织出现严重的病理损伤，TUNEL法显示细胞凋亡明显增加，表明大鼠机械通气相关性肺损伤模型制备成功。

本研究依据文献[7]及预实验结果选择甲泼尼龙的剂量与用法。本实验以甲泼尼龙2、10、30 mg/kg作为低、中、高剂量进行实验，发现Mp1组各指标与V组比较差异无统计学意义；与V组相比，Mp2、3组T3、T4时OI升高，肺组织W/D、LPI、IAR、AI均降低，肺组织病理学损伤减轻，细胞凋亡减少，表明低剂量的甲泼尼龙无明显的肺保护作用，中高剂量的甲泼尼龙具有肺保护作用。

大潮气量机械通气可对肺组织细胞表面产生过度的机械牵张，肺组织上皮细胞受到机械牵张后可激活JNK通路，诱发相关炎性因子的合成与释放加重肺损伤[8]。有研究[9～11]显示，糖皮质激素可通过上调MKP-1表达来抑制JNK信号通路活化，减少相关炎性因子的表达，减轻肺损伤。我们的前期研究也同样发现，甲泼尼龙可通过抑制P38MAPK信号通路活化，减轻大鼠机械通气相关性肺损伤[4]。本研究结果发现，与V组比较，Mp2、3组大鼠肺组织p-JNK蛋白和JNK mRNA表达下降，肺损伤减轻，该结果提示甲泼尼龙减轻大鼠机械通气相关性肺损伤与抑制JNK磷酸化有关，与既往文献[9]报道相符。

JNK磷酸化后可激活BID、BIM、PUMA的促凋亡活性并使其参与线粒体凋亡途径[12,13]。在线粒体途径细胞凋亡过程中，BID、BIM、PUMA可通过激活Bax、Bak或者使Bcl-2、Bcl-XL、MCL-1失活，促进Bax、Bak形成寡二聚体，从而介导细胞色素C从线粒体释放入细胞质，进而级联激活Caspase酶[14，15]。Caspase-3是多种凋亡途径的共同下游效应部分，在细胞凋亡过程中占据核心地位，是凋亡的最终执行者[16,17]。本研究结果显示，与C组比较，V组大鼠肺组织BID、BIM、PUMA、Caspase-3表达增加，细胞凋亡显著，肺损伤较重。提示细胞凋亡在机械通气相关性肺损伤的发生中起着重要的作用，该结果与陈宁等[2]报道相符。有研究显示糖皮质激素可通过降低促凋亡因子Bax与凋亡抑制因子Bcl-2的比值，下调Caspase-3表达，减少细胞凋亡，来减轻大潮气量机械通气导致的大鼠肺损伤[18,19]。本研究结果显示，与V组比较，Mp2、3组大鼠肺损伤减轻，同时伴有BID、BIM、PUMA、Caspase-3表达下降，细胞凋亡减少。该结果提示甲泼尼龙减轻大鼠机械通气相关性肺损伤与下调促凋亡因子表达抑制肺组织细胞凋亡有关。

本研究中Mp2与Mp3组的肺保护作用无明显差别，出现该结果的原因可能是：①大剂量的外源性激素对大鼠自身激素分泌的负反馈调节；②大鼠在应激状态下，体内糖皮质激素受体的表达和活性异常，阻碍了糖皮质激素生物学效应的发挥[20]。这提示我们盲目增加激素剂量并不能产生更好的肺保护效果，中等剂量甲泼尼龙为较合适的肺保护剂量。

综上所述，甲泼尼龙预处理可减轻大鼠机械通气相关性肺损伤，这可能与其抑制肺组织JNK磷酸化，下调唯BH3结构域促凋亡因子BID、BIM、PUMA表达，抑制Caspase-3表达，减少肺组织细胞凋亡有关。

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