阿胶对气道炎症小鼠Th17/Treg亚群失衡的逆转作用

张喆，马云，胡晶红，兰红云，张永清，姚成芳

(1山东中医药大学，济南 250355;2山东省医学科学院基础医学研究所)

大气污染、香烟烟雾等有害颗粒或气体会诱发肺气肿、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等多种呼吸道慢性疾病[1]。Th17细胞/Treg细胞免疫平衡在慢性气道炎症性疾病中扮演着重要角色[2,3]。本草古籍和现代药典中均有阿胶治疗“虚劳嗽咳，肺痿吐脓”等慢性呼吸道炎症以及“补肺气，止嗽止痢”的记载，但其作用机制尚不明确。本研究采用香烟暴露法建立气道炎症小鼠模型，在此基础上使用阿胶灌胃，并观察小鼠肺组织形态、支气管肺泡灌洗液(BALF)的炎症细胞和Th17细胞、Treg细胞亚群比例及IL-6、IL-17A、Foxp3因子表达，探讨阿胶对气道炎症小鼠肺组织Th17/Treg亚群的影响在治疗气道炎症方面发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠24只，体质量18～22 g，6～8周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，26 ℃、12 h交替光照饲养，自由进水进食。

1.1.2 主要试剂及仪器 抗小鼠荧光抗体PE-CD3、percp-cy5.5-CD8、percp-CD4、APC-cy7-IL-17A、APC-INF-γ、PE-IL-5、PE-cy5.5-CD25、PE-Foxp-3均购自eBioscience公司；人外周血淋巴细胞分离液购自TBD sciences公司；TRIzol Reagent、2×Es Taq Master-Mix、dNTP、RNase、5×Buffer购自北京康为世纪生物科技有限公司；M-MLV购自Invitrogen公司，RNA酶抑制剂购于BioBasic公司，二乙基焦碳酸酯(DEPC)、琼脂糖购于AMRESCO公司；丙酮、氯仿、异丙醇、无水乙醇购于天津广成化学试剂有限公司;内参照GAPDH、IL-17A、IL-6、Foxp-3引物由上海博尚生物技术有限公司合成；RIPA裂解液购自Beyotime公司；ELISA IL-17A、ELISA IL-6和ELISA Foxp-3试剂盒均购于联科生物技术有限公司。梯度PCR扩增仪(TGradient，Biometra，德国)；凝胶成像系统(Alplha ImagerTM2200，美国)；电泳仪(Thermo，美国)；酶标仪(Thermo，美国);FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司)。

1.2 气道炎症动物模型的建立与处理 24只小鼠按随机数字法平均分成正常组、模型组和阿胶组。模型组和阿胶组每日两次香烟烟熏，烟熏量10支/次(5支一组，点燃插入40 cm×30 cm×20 cm自制烟熏箱静置15 min，待燃尽后按相同方法点燃第二组5支香烟)，每次烟熏时间共30 min，共24周。模型组小鼠每日0.2 mL PBS灌胃，阿胶组每日给予0.2 mL阿胶溶液(0.2 g/mL)灌胃，共24周。正常组常规饲养。

1.3 观察指标

1.3.1 一般情况 观察各组小鼠精神、体质量一般情况。

1.3.2 血清IL-17A、IL-6、Foxp3水平 小鼠摘眼球后取约1.5 mL外周血离心分离上清，使用ELISA Kit试剂盒检测血清IL-17A、IL-6、Foxp3水平。

1.3.3 BALF细胞分类计数 取血后脱颈椎处死，解剖分离气管周围的组织；气管作一横行切口，插入气管插管，结扎右主支气管；经气管插管以10 mL生理盐水分3次灌洗左肺后，回收的BALF作细胞分类计数。

1.3.4 肺组织病理 取右肺上叶置于4%甲醛溶液中，按照常规方法制作石蜡切片，切片使用HE染色来评价其病理改变，具体标准主要参考文献[4]中的方法来确定。

1.3.5 肺组织Th17细胞、Treg细胞比例 右肺中叶经过消化、研磨、破红、过滤等操作制备单核细胞悬液。调整单个核细胞浓度(1×106/管)后离心，沉淀用1.5 mL刺激液重悬，转移至24孔板中，于CO2细胞培养箱37 ℃培养6 h。经过滤转移至EP管中，1×PBS洗2次，离心后弃上清，沉淀加入小鼠血清重悬后室温避光封闭15 min。按说明书参考抗体浓度加入外标抗体(PE-CD3、percp-CD4、percp-cy5.5-CD8、PE-cy5.5-CD25)，4 ℃避光孵育30 min。1×PBS洗2次，加入穿膜固定液500 μL，4 ℃固定30 min，固定后细胞用穿膜液洗2次后加入500 μL穿膜液4 ℃避光孵育30 min。按说明书加入内标抗体(APC-cy7-IL-17A、PE-Foxp-3)，4 ℃避光孵育1 h后用800 μL 1%多聚甲醛4 ℃避光12 h。PBS重悬细胞，转管，上机检测，采用Flowjo7.6分析Th17亚群(CD4+IL-17A+)及Treg亚群(CD4+CD25+Foxp3+)比例。

1.3.6 肺组织IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表达 将右肺第三小叶置于经DEPC处理的EP管中，采用TRIzol Reagent提取样本总mRNA，采用oligo dT为RT反应引物。PCR反应条件:RNase free water 6.5 μL，Taq酶12.5 μL，RT反应产物4 μL，上、下游特异性引物各1 μL，总体积20 μL。PCR循环参数:预变性95 ℃，5 min；94 ℃，1 min;58 ℃，1 min；72 ℃，1 min，30个循环，末次循环后72 ℃延长10 min。PCR产物经1.2%凝胶电泳，结果采用Alpha凝胶成像系统分析图像，以GAPDH为内参照，以目的基因与同步GAPDH灰度值比值作为相对表达量。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况 模型组小鼠体质量增长缓慢，出现被毛枯黄、脱落、易激惹等表现；阿胶组被毛枯黄、脱落、易激惹现象较模型组相对减轻，体质量正常增长。第24周末，正常组、模型组和阿胶组体质量分别为(26.51±1.89)、(24.32±1.90)、(26.38±1.96)g，模型组与正常组相比，阿胶组与模型组相比，P均<0.05。

2.2 各组小鼠BALF细胞分类计数比较 见表1。

表1 各组小鼠BALF细胞分类计数比较

注：与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

2.3 各组小鼠肺组织病理结果比较 正常组小鼠肺组织结构正常。模型组小鼠肺间质有大量炎性细胞浸润，肺泡破裂融合，肺泡数量减少、直径变大，形成肺气肿，出现毛细血管扩张和红细胞渗出，肺间质明显增厚。阿胶组小鼠肺组织炎性细胞浸润程度明显降低，肺间质增厚不明显，无红细胞渗出，肺脏炎症情况明显改善，切片与正常组基本一致。

2.4 各组小鼠肺组织Th17细胞、Treg细胞比例比较 见表2。

表2 各组小鼠肺组织Th17细胞、Treg细胞比例比较

注：与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

2.5 各组小鼠血清IL-17A、Foxp3、IL-6水平比较 见表3。

表3 各组小鼠血清IL-17A、Foxp3、IL-6水平比较

注：与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

2.6 各组小鼠肺组织IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表达比较 见表4。

表4 各组小鼠肺组织IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表达比较

注：与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

3 讨论

大气细颗粒物(PM2.5)污染、吸烟与被动吸烟均是人类COPD发生的主要危险因素。吸入有害颗粒或气体可导致肺部炎症，炎症反应中被激活的炎症细胞释放多种介质，这些介质能破坏肺的结构和(或)促进中性粒细胞炎症反应，PM2.5还可以加重原有气道炎症的发展[5]。T淋巴细胞亚群及细胞因子表达失衡与COPD发病的相关性已被国内外诸多研究[4,6]证实，其中Th17细胞/Treg细胞免疫平衡在COPD的免疫学发病机制中扮演着重要角色[7]。烟雾等有害颗粒或气体刺激可引起气道上皮细胞的损伤，激活抗原呈递细胞分泌大量IL-1β、IL-6等炎性细胞因子，促使CD4+T细胞向Th17细胞分化增殖介导自身免疫反应。同时，Th17细胞分泌IL-17、IL-21、IL-22等促炎细胞因子，募集中性粒细胞和巨噬细胞浸润至炎症组织，释放弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMPs)破坏肺组织。肺组织损伤和基质损伤后释放的弹性蛋白片段同样可作为自身抗原，刺激更多炎性介质释放，形成“瀑布效应”[8]。鼠类实验和人类研究都表明，Th17细胞因子在COPD小鼠肺组织中的表达显著上调[9]，在肺气肿小鼠肺脏的表达也显著增加[10,11]。IL-6是Th17细胞刺激上皮细胞和成纤维细胞间接分泌的主要的致炎性因子，同时也是促进Th17细胞分化的调控因子[12]。IL-6的增加不仅募集中性粒细胞到炎症部位加剧炎症反应，同时诱导初始T细胞向Th17细胞分化，进一步加重Th17介导的炎症反应。调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)通过其免疫抑制能力在维持免疫稳态和耐受中发挥重要作用。机体发生炎症反应时，会通过上调Treg亚群抑制机体过强的免疫反应来保护宿主，避免因过强的免疫反应造成严重病理损害，其在炎症中表达的差异可以间接反映炎症的严重程度[13,14]。

目前，西医治疗非感染性炎症主要依赖激素调节，但长期使用激素会导致机体免疫功能受到抑制，抗病原微生物及肿瘤监视功能降低。本草古籍和现代药典中均有阿胶治疗“咳嗽”的记载，如《本草备要》中有阿胶治疗“虚劳嗽咳，肺痿吐脓”的记载，《本草纲目》中有阿胶治疗“肺风喘促，多年咳嗽”的记载，《本草约言》中有阿胶“补肺气，止嗽止痢，治痿等剂皆用之，惟久而虚者宜之”的记载，但现代医学对于阿胶治疗气道炎症的机制研究还处于起步阶段。以往研究[15]发现，阿胶的抗炎机制可能与改善组织血管通透性，降低炎性渗出，提高机体抗氧化能力，减少过氧化物积累，减轻氧化应激反应的作用有关。赵福东等[16]研究结果显示，阿胶可以通过降低哮喘模型动物外周血IL-4因子表达水平逆转Th2细胞优势状态，从而减轻气道嗜酸性粒细胞浸润，但从干预Th17细胞/Treg细胞亚群失衡角度治疗呼吸系统炎症的作用机制未见文献报道。本研究采用香烟烟雾暴露法复制气道炎症小鼠模型，探讨烟尘暴露下肺脏局部Th17细胞及细胞因子的变化以及阿胶的逆转作用。结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肺组织Th17细胞、Treg细胞比例高，血清IL-17A、IL-6、Foxp3水平和肺组织IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表达高，肺间质有大量炎性细胞浸润，肺泡破裂融合；与模型组相比，阿胶组小鼠肺组织Th17细胞、Treg细胞比例低，血清IL-17A、IL-6、Foxp3水平和肺组织IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表达低，肺脏炎症情况明显改善。

综上可见，香烟暴露导致的气道炎症小鼠肺组织Th17细胞、Treg细胞比例高，阿胶可能是通过减少炎症部位升高的Th17细胞、Treg细胞比例，逆转Th17/Treg亚群失衡状态抑制气道炎症而发挥治疗作用。

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