蛋白质组学在非小细胞肺癌生物标记和靶向药物治疗中的应用进展

宁德利，金铭，徐涛，孙辑凯，李敏

(齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔161006)

肺癌是目前全球发病率、病死率最高的恶性肿瘤之一[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌病例的85%[2]，其主要的组织学类型为鳞状细胞癌(SqCC)和腺癌(ADC)[3]。随着蛋白质组学和肿瘤分子生物学的发展，生物标记及药物靶向治疗成为肿瘤治疗的发展方向和有效手段。特别是随着质谱技术的快速发展，蛋白质组学作为可以对整体蛋白表达进行有效估量的工具[4]，已广泛应用于发现疾病生物标记和药物靶向治疗，使NSCLC患者有望得到个性化治疗。现就蛋白质组学在NSCLC生物标记和靶向药物治疗中的应用进展进行综述。

1 蛋白质组学在NSCLC生物标记中的应用

1.1 诊断性生物标记 在NSCLC发生发展中，常伴有某些蛋白质的过量表达或抑制表达，通过比较正常样本及患病样本在蛋白质种类和丰度上的表达差异，可以确定和筛选特异的NSCLC标记物，将有助于肺癌的早期诊断。

肺癌中一般检测不到癌胚抗原(CEA)的特异性，其在NCSLC的敏感性只有40%～70%，因此肺癌发展早期临床诊断的效率低下。近来有学者[5]通过同位素相对标记及绝对定量(iTRAQ)与液相-串联质谱分析技术，对凝集素亲和层析富集的NCSLC患者血清进行研究，发现糖蛋白AACT在NSCLC早期阶段表达量降低。此外，还发现GlcNAc糖基化的AACT可作为NCSLC早期诊断的标记物。Marien等[6]采用基于质谱的磷酸脂质组学鸟枪法和双向脂类组学图谱分析技术，对NSCLC和与其配对的正常肺组织样本磷脂数据进行研究。结果发现，其中鞘磷脂(SMs)表达量显著降低，而特定磷脂酰肌醇(PI)显著升高。这些脂类标记能够说明NSCLC或其亚型存在，此种方法将成为NSCLC的有效诊断工具。

钙网蛋白(CANX)在血清中的表达水平对NSCLC的疾病进程具有重要意义。Kobayashi等[7]采用联合免疫沉淀反应、基质辅助激光解析离子化-飞行时间-质谱技术(MALDI-TOF-MS)和反相蛋白阵列技术，分析肺癌患者和正常对照的血清样本。结果发现，CANX水平在肺癌第一阶段就上调表达，并且随着病情的加重，CANX表达水平显著升高。因此，血清CANX水平可作为早期肺癌检测标记。

Liu等[8]采用深度非标记定量蛋白质组学技术，对胸腔积液样本进行研究。发现NSCLC患者的肝细胞生长因子受体(MET)、二肽基肽酶4(DPP4)和蛋白酪氨酸磷酸酶受体F(PTPRF)的蛋白水平表达显著高于良性对照组。该研究表明，用这种方法建立一个新的胸腔积液蛋白质组的数据库，有利于从良性肿瘤中鉴定出NSCLC的治疗靶点。

蛋白糖基化在癌细胞生长、分化和迁移过程中发挥着重要的调节作用。Yang等[9]对NSCLC的两个亚型ADC和SqCC做了糖基化蛋白和总蛋白的组学分析，发现中性粒细胞弹性蛋白酶(ELANE)和类胰岛素生长因子结合蛋白3(IGFBP3)两个糖基化蛋白在SqCC中高度表达，而聚集蛋白多糖(ACAN)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)、凝血栓蛋白1(THBS1)、生长因子β1结合蛋白1(LTBP1)、鞘脂激活蛋白(PSAP)和胶原蛋白Ⅰ型α2(COL1A2)在ADC中高度表达。此外，通过信号网络分析软件可以鉴定NSCLC致病相关蛋白的上游调控因子。

吸烟者患肺癌的比例是不吸烟者的15～30倍。Rice等[10]应用同位素相对标记相对与绝对定量技术，对吸烟者和不吸烟者的血浆样本进行研究，发现吸烟者血浆样本中的载脂蛋白E(Apo E)表达水平显著高于不吸烟者。此外还发现，鳞状转移瘤恶化前Apo E在血浆和组织中表达有着重要的联系。Apo E的表达水平是一种新的鳞状转移瘤早期形态变化的诊断生物标记物。

1.2 预测性生物标记 蛋白质组学的发展为肺癌治疗新靶点的鉴定带来了新的变革。Xiao等[11]利用链亲和素琼脂糖Pulldown实验及蛋白质组学分析鉴定，确认Ku80(参与修复破碎DNA双链的Ku二聚体)是一种作为环氧化酶-2(COX-2)基因启动子的新型结合蛋白，转录辅激活子CRED结合蛋白(CBP)的过表达可以增加Ku80乙酰化作用，从而促进COX-2表达和肿瘤的生长，提示Ku80是肺癌发生和发展的一个潜在的治疗靶点。Xu等[12]采用基于细胞同位素标记的定量蛋白质组学技术，鉴定经紫杉醇处理的细胞蛋白质丰度变化，发现程序性细胞死亡因子4(PDCD4)表达下调，肺癌组织中的PDCD4高水平表达与接受紫杉醇治疗的肺癌患者生存时间呈正相关，表明PDCD4为潜在的肺癌患者抵抗紫杉醇的预测标记。

纳米颗粒载药化疗法可以提高药物输送效果和减少毒性。为了更好地了解耐药细胞对纳米颗粒治疗法的响应，Zhao等[13]利用定量蛋白质组学的方法，研究白蛋白结合型纳米颗粒紫杉醇治疗NSCLC细胞的蛋白质表达情况，发现环指蛋白139(RNF139)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1(HMGCS1)在脂质代谢过程中过表达，与白蛋白结合型纳米颗粒紫杉醇抗性相关，表明这些蛋白质可能是预测纳米颗粒治疗NSCLC抗性的生物标记物。此外，Walker等[14]利用一个八通道同位素标签串联质谱的蛋白质组学技术，检测患者在放疗前和放疗中的血浆样本。结果发现，放射治疗1周后的C反应蛋白(CRP)和富亮氨酸α2糖蛋白1(LRG1)在生命延长的群体样本中有显著变化，为进一步决策NSCLC患者是否接受放射治疗提供实验依据。

为能够接受靶向治疗的患者找到预测标志物，是制定有效治疗方案的必要因素。事实上，Cho[15]在比较NSCLC细胞的抗药性和敏感性时发现，蛋白翻译后磷酸化变化明显比转录水平的剧烈。提示蛋白表达和翻译后修饰可为靶向药物治疗患者的潜在标记提供依据。

1.3 预后性生物标记 针对癌症患者选择不同方案的治疗结果，预后标记可作为识别和分析的一个重要工具。Wang等[16]利用基于SILAC的定量蛋白质组学结合免疫沉淀技术，对侵袭肺ADC的特异核转运蛋白(KPNA2)蛋白复合体进行研究，发现与早期相比，晚期的ADC组织中KPNA2-波形蛋白-磷酸化的细胞外信号调节激酶(Erk)复合体水平显著升高，表明KPNA2的过表达与癌症侵袭和细胞迁移相关，进而表明KPNA2水平的检测可能是一个潜在的ADC的预后标记。Xu等[17]通过基质辅助激光解析离子化-质谱技术(MALDI-MS)，对NSCLC切割组织进行研究，发现Ⅰ期NSCLC的不良预后也与波形蛋白和非肌球蛋白阳性表达相关，波形蛋白和非肌球蛋白过表达可作为判断细胞转移和恶性肿瘤复发的标志。

还有研究表明，血清中CRP和血清淀粉样蛋白A(SAA)水平的升高也可作为肺癌的预后标记。Zhang等[18]运用差异蛋白质组学方法分析确定，在肺癌患者的血清样本中存在着CRP结合SAA(CRP-SAA)蛋白体。与健康对照相比，低存活率患者中CRP-SAA蛋白水平显著升高。此外，单变量和多变量Cox分析表明，CRP-SAA可以作为一个独立的早期肺癌患者的预后标志。

2 蛋白质组学在NSCLC靶向药物治疗中的应用

靶向药物治疗是NSCLC的一个重要的治疗手段。然而，需要根据不同患者不同分子病理情况来选择各种敏感性和耐药性的靶向治疗方案，且药物作用机制多与信号通路相关。

2.1 表皮生长因子受体(EGFR)为靶向的药物治疗 对于治疗EGFR突变的NSCLC，酪氨酸激酶抑制剂(TKI)已经成为一种很有前景的选择。然而，许多患者都是从最初对EGFR-TKI产生反应，到最后产生了抗药性。Koch等[19]运用激酶亲和纯化与质谱定量的化学蛋白质组学方法，发现在EGFR突变的NSCLC细胞中，促红素人肝细胞受体酪氨酸激酶A2(EPHA2)表达水平高于对照的10倍以上。此外，敲除EPHA2能够降低局部粘着斑激酶(FAK)磷酸化和细胞迁移。这表明，EPHA2的过表达与NSCLC的EGFR-TKI抗药性相关，是产生EGFR-TKI耐药性NSCLC患者的潜在药物靶点。尽管如此，仍有30%的患者耐药机制不清，Wang等[20]利用定量的磷酸蛋白质组学及蛋白质组学的技术，对吉非替尼处理过的敏感和非敏感NSCLC细胞进行比较，在综合鉴定的1 548个磷酸化蛋白和3 834个蛋白中，发现以CK2为核心的信号网络与吉非替尼抗性相关。

和吉非替尼一样，厄洛替尼也是常用的TKI，对NSCLC患者有很好的疗效。Bosse等[21]通过细胞培养条件下稳定同位素标记技术，对厄洛替尼敏感和非敏感NSCLC细胞株进行蛋白定量分析，在900多个变化蛋白中，发现组织型纤溶酶原激活蛋白(tPA)、EGFR、尿基型纤溶酶原激活蛋白(uPA)、血小板源生长因子D(PDGF-D)和骨髓源生长因子(MYDGF)呈现显著变化，其中tPA在厄洛替尼非敏感NSCLC细胞株中过表达，并证明了有14种蛋白质与tPA相互作用，对NSCLC细胞厄洛替尼耐药性的机制有了进一步的阐释。

Pan等[22]在用伊诺肝素和吉非替尼处理NSCLC细胞的愈伤及细胞迁移的实验中，采用了凝胶电泳和液质联用技术进行分析。结果发现，胞质分裂作用因子1(DOCK1)和细胞骨架中间丝波形蛋白的表达，在细胞迁移过程中发挥重要作用。综合蛋白质组学和通路分析显示，DOCK1表达和波形蛋白磷酸化可以作为预测吉非替尼对NSCLC作用的潜在标记物。可以通过伊诺肝素判断出吉非替尼抑制肿瘤和细胞迁移的活性，主要是通过抑制DOCK1表达和波形蛋白磷酸化实现的。

2.2 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂为靶向的药物治疗 雷帕霉素是目前应用最为广泛的一种mTOR抑制剂，通过调控信号通路阻断细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤血管生成，达到抗肿瘤的作用。但从长期疗效来看，雷帕霉素的利用率低，稳定性差。Fan等[23]利用iTRAQ标记蛋白质组学技术，对白藜芦醇衍生物(TMS)处理过的H1975细胞和正常细胞进行总蛋白比较分析，发现78个蛋白表达上调，75个蛋白表达下调。而其中有22个蛋白与mTOR信号通路及下游核糖体生物合成相关。经TMS处理的H1975细胞中，CaMKKβ-AMPK-mTOR通路的重要蛋白AKT、mTOR、P70S6K和S63丰度显著下调，表明TMS具用抑制mTOR的作用，但仍需更多的临床试验进一步验证。

2.3 其他信号传导途径为靶向的药物治疗 尽管EGFR抑制剂的靶向治疗已经应用于临床实践中，但对于吸烟引起的癌症患者没有明显的治疗效果。因此，通过研究香烟烟雾诱发信号机制找到替代药物的靶点，成了迫切需要解决的问题。通过细胞培养条件下稳定同位素标记及亲和富集磷酸化肽段技术，鉴定暴露在香烟烟雾中异常表达的磷酸化肽段，发现烟雾中H358细胞有278个磷酸位点过度表达，其中包括p21相关激酶6(PAK6)和EGFR。PAKs作为Rho GTPase蛋白的下游效应因子，参与多种重要的细胞生命活动，如细胞增殖、细胞运动和转录激活等[24]，而在前列腺癌、乳腺癌和肝细胞癌中，PAK6都呈现过度表达[25]。表明PAK6可能作为治疗NSCLC特别是吸烟患癌者的潜在靶标[26]。

Flores-Pérez等[27]在验证没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)是否可以与顺铂产生协同效应时，采用双向凝胶电泳和电喷雾电离—多级质谱技术，对NSCLC细胞的调控蛋白进行鉴别，发现肝癌衍生生长因子(HDGF)受到EGCG的抑制作用，呈现3倍以上的下调表达现象。这种通过EGCG减少HDGF表达的方法，能提高化疗所致的细胞凋亡率，从而使NSCLC细胞对顺铂治疗更加敏感，因此可以利用EGCG降低HDGF的水平，进而作为顺铂治疗NSCLC患者的一个新的治疗靶点。

蟾毒灵(CS-6)是蟾酥中重要的蟾二烯羟酸内酯，在癌症治疗过程中具有代谢稳定和副作用小的特点，又能让NSCLC的A549细胞阻滞在G2/M期和凋亡。Zhang等[28]利用定量蛋白质组学技术发现了38个CS-6作用的潜在靶点蛋白，其中31个是网络互作蛋白，1个是重要的节点蛋白热激蛋白90(HSP90)。CS-6通过与HSP90结合的ATP相互作用，抑制HSP90分子伴侣的功能，进而降低HSP90相关蛋白的表达。表明CS-6可有效抑制肿瘤生长，为NSCLC的临床治疗提供了实验证据。

另外，几种周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂应用于临床实验治疗NSCLC。Sumi等[29]运用无偏差质谱化学蛋白质组学方法，对帕博西尼和瑞博西尼处理的肺鳞癌组织进行分析，发现CDK9是除CDK4/6外的另一个药物治疗靶点。此外，帕博西尼还特异与几种脂质激酶相互作用，其中酪蛋白激酶2和磷酸肌醇3激酶调配亚基4调控细胞凋亡，而PI-3激酶催化亚基δ和PI-5-磷酸盐-4激酶2型A/B/C则与AKT信号传导相关。表明帕博西尼作为脂质激酶抑制剂，通过调控PI3K/AKT信号途径促进癌细胞凋亡。

蛋白质组对研究人类NSCLC精准肿瘤学很重要。尽管最近利用蛋白质组学技术鉴定了许多NSCLC潜在的治疗靶点，但在临床应用上还很少，因此，如何缩短蛋白质组学结果与临床应用的差距至关重要。仅研究蛋白标记的差异表达对临床应用来说是远远不够的。要在综合多种组学方法的基础上，构建人体组织蛋白质组图谱，从而得到蛋白质的空间定位，直至单细胞水平[30]。定位人体全蛋白质组的人类蛋白质组计划，将为研究人员提供丰富的肽段和蛋白数据库，为诊断、预后、治疗和预防医学应用提供便利，也将为NSCLC的靶向治疗提供发展平台。

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