高脂饮食对雌性大鼠性发育中枢相关基因GnRH mRNA及GnRH-RmRNA表达水平的影响

董逸翔，陈华，矫金玲，陶敏

性发育特征初显年龄较正常儿童平均年龄提前2个标准差以上[1]，或男童在9岁、女童在8岁前出现第二性征者[2]称为性早熟。在临床上根据其发病机制和病因又分为中枢性与外周性两大类。

现今已证实儿童性成熟年龄的提前主要是外界因素作用的结果，其中营养饮食结构的改变尤为重要[3]。笔者团队前期研究发现高脂肪饲料喂养的幼龄雌性SD大鼠，其阴道开口及第一次发情间期均提早出现，其子宫、卵巢指数增高，血清促黄体生成素（LH）水平上升，表明高脂饮食可促使大鼠青春期启动提前[4]。本实验将继上述研究，以下丘脑GnRH mRNA与垂体GnRH-R mRNA为观察指标[5]，从基因层面探讨高脂饮食对性发育中枢下丘脑-垂体-性腺轴（HPGA）的影响。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物分组 出生21d清洁级断乳SD雌性大鼠10窝，购自上海西普尔—必凯实验动物有限公司，合格证号为2008001601321，平均体质量为（45±5）g，饲养在浙江中医药大学动物实验中心。按配对设计原则，依据窝别与体质量选取20只大鼠，分为高脂组与标准组，各组10只，分别喂饲高脂肪饲料及标准饲料，并于温度18～23℃，湿度60%～80%，每天14 h光照的环境下自由摄食、饮水。

1.2 动物饲料 标准饲料、高脂饲料由南通特洛非饲料科技有限公司提供，高脂饲料的脂肪供能比在标准饲料的基础上上调至45%[6]。各组饲料具体成分见表1。

1.3 实验方法 高脂组予高脂肪饲料，标准组予标准饲料，自由摄食、饮水，从实验第1天（大鼠21日龄）至大鼠处死日（大鼠36日龄），每天9：00观察大鼠阴道口开放情况。对阴道口开放的大鼠，每天进行阴道细胞涂片观察其性周期的变化。待高脂组大鼠均出现阴道口开放时，即实验第16天、大鼠36日龄时，于当天15：00在水合氯醛麻醉下处死所有大鼠，获取下丘脑及垂体，置于－80℃冰箱冻存备用。组织总RNA提取、cDNA第一链合成、PCR反应及检测等操作均严格按照试剂盒说明书进行，最后以Realtime-PCR技术，将 -actin作为内参，相对表达量“2－△△Ct”值来表示目的基因下丘脑GnRHmRNA和垂体GnRH-RmRNA的相对表达水平。

1.4 试剂及引物 RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂均购自北京天根生化科技有限公司，批号分别为 L1029、L0924、L1008；PCR引物根据Gene Bank提供序列由上海生工生物工程公司合成，其核苷酸序列如下：-actin正向5’-TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3’，反向 5’-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3’，产物 155bp；下丘脑GnRHmRNA正向5’-TGGTATCCCTTTGGC TTT-3’，反向 5’-CTCCTC CTT GCC CAT CTC-3’，产物188bp；垂体GnRH-RmRNA正向5’-GACGGT GAC TTT CTT CCT TTT C-3’，反向 5’-CTC TCC AGCATA CCA CTGAACA-3’，产物 169 bp。

1.5 统计方法 实验数据采用SPSS17.0统计软件包分析统计。由于相对表达量“2－△△Ct”为非正态分布的数据，统计时先转换成正态分布数据，数据以均数±标准差表示，采用 检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下丘脑GnRH mRNA相对表达量比较 高脂组大鼠下丘脑GnRHmRNA相对表达水平高于标准组（=2.307＜ 0.05），见表 2。

2.2 垂体GnRH-R mRNA相对表达量比较 高脂组大鼠垂体GnRH-RmRNA相对表达水平高于标准组（=4.359＜ 0.01），见表 3。

表1 各组饲料成分及各成分含量 g

表2 两组间下丘脑GnRH mRNA相对表达量比较

表3 两组间垂体GnRH-RmRNA相对表达量比较

3 讨论

自20世纪60年代以来，随世界经济发展、营养状况改善，出现了儿童体格以及青春发育年龄提前的世界性趋势，迄今为止已明确青春期发育会受到基因、营养健康状况、环境及社会经济等因素的影响。瑞典一项调查显示[7]：将生活条件相对落后国家的女孩移民至比利时之后，有1/3出现了性发育提前；之后研究证实这一部分女孩在移民之前以低蛋白、低热量的素食为主，移民后饮食结构向高热、高脂、高蛋白饮食转变。我国也有相关调查表明，已确诊为性早熟的患儿其日常饮食中摄取的动物类食物较正常同龄儿童多[8]，这些都提示了青春期发育提前与饮食结构以及肥胖率之间存在一定的关联性。

在人类正常青春期发育与中枢性性早熟发病过程中，HPGA功能的激活至关重要。性发育启动前，HPGA处于相对静止状态[9]；性发育开始启动时，GnRH分泌增加，激活垂体分泌促黄体生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH），从而促进性腺分泌，可见青春期的启动一定程度上源于HPGA的准确发动。对于人类，上述过程启动的年龄跨度很大，其调控因素复杂，但可以肯定的是很多情况下是发生在基因水平上的[10]。有国外研究显示，人群中性成熟的年龄接近于正态分布，提示了性早熟性状的差异并非只缘于单一位点的突变，而是由多基因共同决定的[11]。

作为研究性发育的首选实验动物，SD大鼠的HPGA功能与人类相似，其性周期明显短于人类，性发育特征表现明显，便于实验观察。大鼠青春期启动、HPGA激活，此时与性发育相关的一系列基因表达水平出现相应的生物学改变[12]，譬如下丘脑GnRH mRNA表达水平开始提升，并指导合成GnRH；垂体GnRH-R mRNA表达水平相应提升，指导合成GnRH-R，两者为配受体关系。当GnRH脉冲式分泌水平上调、脉冲幅度增大、出现昼夜节律性变化时，接受GnRH刺激的垂体细胞膜表面GnRH-R也相应增加，GnRH与GnRH-R结合所释放的一系列生物信号促使垂体前叶分泌LH、FSH，进而影响性腺分泌相关性激素，HPGA功能从而完全启动。

本实验说明，相比于正常标准饮食，高脂饮食更容易引发大鼠HPGA提前启动，进而导致性发育提前；从基因层面上看，高脂饮食对于HPGA的影响可以通过促进大鼠下丘脑GnRH mRNA、垂体GnRHR mRNA这些性发育相关基因的表达实现，这都提示了合理饮食、避免摄入过多脂肪应作为预防性早熟的重要措施。至于高脂饮食是否可影响其他性发育相关基因的表达，其作用又是通过哪些途径发生；基于人类日常饮食结构，不可能只进食高脂饮食，故而高脂、高蛋白混合饮食是否可致HPGA提前启动，混合饮食相对于单纯高脂饮食是否更易引发性早熟等问题仍需进一步研究。

参考文献：

[1] 薛辛东,杜立中,毛萌.儿科学[M].北京：人民卫生出版社,2010：467-470.

[2] 性早熟诊疗指南（试行）【卫办医政发（195）号】[J].中国儿童保健杂志,2011,19(4)：390-392.

[3] 孙艳,俞建.性早熟病因的研究进展[J].实用儿科临床杂志,2011,26(20)：1599-1601.

[4] 矫金玲,陈华,董逸翔,等.高脂肪饮食对大鼠青春期启动影响的实验研究[J].浙江中西医结合杂志,2015,25(1)：5-7.

[5] 田占庄,赵宏,陈伯英.达那唑诱导的雌性性早熟大鼠GnRH及其受体mRNA的表达[J].中华内分泌代谢杂志,2003,19(5)：399-401.

[6] 杨爱君,崔雁,叶卉初,等.营养性肥胖动物模型的建立[J].临床和实验医学杂志,2005,4(3)：156.

[7] Bona G,Marinello D.Precociouspuberty in immigrant children：indications for treatment[J].JPediatr Endocrinol Metab,2000,13(1)：831-834.

[8] 马艳荣,于白莉.浅谈性早熟的病因病机[J].中国中医药现代远程教育,2011,9(19)：104-105.

[9]Terasawa E,Fernandez DL.Neurobiological mechanisms of the onsetof puberty inprimates[J].Endocr Rev,2001,22(1)：111-151.

[10]郭正霞,辛秀娟,肖君华,等.性早熟相关基因的研究进展[J].国外医学：儿科学分册,2004,31(6)：300-302.

[11]Palrnert MR,Hirschhon JN.Genetic approachesto stature,pubertal timing and other complex traits[J].Mol Cenet Metab,2003,80(1-2)：1-10.

[12]Gore A.C,Yeung G,Morrison JH.Neuroendocrine aging in the femalerat：thechanging relationship of hypothalamic gonadotropin-releasing hormone neurons and N-methyl-D-aspartate recept ors[J].Endocrinology,2000,141(12)：4757-4767.