喉鳞状细胞癌组织中YPEL3基因启动子甲基化及其临床意义

曹炳，沈志森，林乐希，郝文娟，周重昌

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，90%以上喉癌的病理类型是鳞状细胞癌。尽管近几十年来，喉癌的预防、诊断和治疗取得了很大进步，但5年生存率仍然很差[1]。手术辅助放化疗是目前最常见的治疗方法，然而治疗后患者易出现言语障碍和呼吸困难，降低了患者生活质量[2]。喉癌的发病机制复杂，涉及遗传、表观遗传和环境因素。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰。大量研究证实，DNA异常甲基化引起表达抑制或沉默，从而促进了肿瘤的发生和发展[3]。

人类YPEL3定位于16p11.2，是一个p53信号通路中受p53调控的肿瘤抑制因子，其编码的蛋白质能够诱导人类肿瘤细胞的老化而引起其生长停滞[4]。有研究表明，YPEL3表达下调可以增加肿瘤细胞迁移和侵袭性，从而促进了癌症的发生和进展[5]。另外，YPEL3的表达在卵巢癌中由于启动子高甲基化而下调[6]。然而，YPEL3启动子甲基化与喉癌相关性的研究尚无报道。因此，笔者研究YPEL3基因在喉癌中的甲基化状态，并分析YPEL3启动子甲基化水平与临床病理特征的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年1月至2016年1月宁波大学附属李惠利医院收治的喉癌患者的癌组织及对应的癌旁正常组织91例，并收集患者基本临床病理资料，所有患者均排除术前放化疗史和癌症史。其中男87例，女4例；年龄40～86岁；73例既往有吸烟史。分期参照国际抗癌协会（UICC）TNM分类标准（2002）：I/II期44例，III/IV期47例。此外，高中分化鳞癌78例，低分化鳞癌13例；有淋巴结转移的32例，无淋巴结转移的59例。组织切除后立即投入液氮，然后转存－80℃冰箱冷冻保存。所有参与者签署了知情同意书，并获得本院伦理委员会的批准。

1.2 DNA提取和亚硫酸氢盐修饰 根据制造商的说明书，使用 QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）从 91对组织标本中提取基因组DNA。使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific Co.Ltd.，Wilmington，USA）评估DNA质量和数量。严格按照制造商的说明书（Zymo Research，Orange，CA，USA），使用具有ZYMOEZDNA Methylation-Gold Kit的Methylamp DNA修饰试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰。

1.3 实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应（qMSP） 采用qMSP检测YPEL3基因启动子甲基化状态。操作步骤按照LightCycler 480（德国Roche Diagnostics公司）进行扩增。qMSP所需引物：YPEL3-正 义 5’-TTAGGTGATTTTTAATTTTTACGGC-3’，YPEL3- 反 义 5’-CTAAACTATCAATTCCCAATTTCGA-3’。内参为 -actin基因（ACTB），ACTB-正义5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’，ACTB-反义5’-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’。PCR反应的体系为20l，包括 ddH2O 6l，模板 DNA 2l，PCR Buffer 10l，上下游引物各1l。PCR反应条件为：95 ℃预变性 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72℃30 s，共50个循环。采用亚硫酸氢盐转化通用甲基化人类DNA标准（ZYMO研究公司）作为阳性对照。ACTB被用作内部控制。qMSP可以通过甲基化指数（PMR）进行指标量化。PMR代表基因甲基化阳性的模板DNA在其中所占的比例。PMR=2－ Ct×100%，其中 Ct=（Ct样本－Ct内参）－（Ct阳参－Ct内参）。

1.4 统计方法 采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示。＜0.05为差异有统计学意义。

表1 喉鳞状细胞癌患者YPEL3甲基化与临床病理参数的关系

2 结果

2.1 YPEL3基因启动子甲基化在喉癌组织和癌旁正常组织中的状态 喉癌组织中 YPEL3启动子甲基化水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见封二彩图10。

2.2 YPEL3基因启动子甲基化与临床病理特征的相关性 男性患者 YPEL3基因启动子甲基化水平明显高于女性患者（P＜0.05），有吸烟史的患者YPEL3启动子甲基化水平明显高于无吸烟史患者（P＜0.05），与高中分化癌组织学类型的患者相比，低分化的患者的YPEL3甲基化水平增加（P＜0.05）。然而，YPEL3甲基化与年龄、临床分期、T分期及淋巴结转移无关（P＞0.05）。见表1。

2.3 YPEL3基因在喉癌中的诊断价值 ROC曲线下面积（AUC）高达 0.697（95%CI=0.620 ～ 0.774，P＜0.01）。取最大约登指数作为截点，甲基化率的临界值为0.0872，此时预测喉癌的敏感度和特异度分别为50.50%和86.80%。见封二彩图11。

3 讨论

喉癌的发生、发展与相关抑癌基因的失活相关，而这些抑癌基因失活的机制中，喉癌相关基因的异常甲基化是其中极为重要的机制之一，包括CBY、IGFBP-rP1和 MYCT1。

YPEL基因家族包括5个成员，即 YPEL1～YPEL5。YPEL家族蛋白的功能与细胞分裂相关联。YPEL3是依赖p53蛋白调控的基因，其编码蛋白通过引起程序性细胞死亡而诱导细胞的增殖抑制。

YPEL3基因启动子异常甲基化在肿瘤中发挥重要作用。Kelley等[5]发现与正常组织相比，卵巢癌组织中YPEL3启动子甲基化率增高，而YPEL3表达下调，从而抑制细胞凋亡，促进癌细胞生长和增殖。本研究发现，与癌旁正常组织相比，喉癌组织的YPEL3启动子甲基化率明显增高，提示YPEL3甲基化是喉癌常见的特异性事件，并且有可能作为喉癌早期诊断的生物标记物。

喉鳞状细胞癌的组织学类型对其治疗和预后具有重要的意义[6]。本研究表明YPEL3可能在喉癌的进展中发挥关键作用，可作为LSCC分化程度判定的潜在分子生物学标记物。吸烟是导致喉癌和肺癌的重要环境诱导因素。吸烟会引起基因DNA甲基化异常，促进肿瘤的发生和进展[7]。肺癌相关基因甲基化研究表明，有长期吸烟史的肺癌患者的基因启动子甲基化率明显高于无吸烟史的肺癌患者[8]。本研究发现吸烟者的YPEL3启动子甲基化水明显高于无吸烟者。说明吸烟可能通过提高YPEL3甲基化水平，从而促进喉癌的发生和进展。

喉癌相关肿瘤标记物包括癌胚抗原（CEA）、组织多肽抗原（TPA-M）、鳞状细胞癌抗原（SCCA）和细胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）。而CEA、TPA-M、SCCA和 CYFRA 21-1在喉癌诊断中的敏感度为16.5%～46.8%[9]。本研究发现，YPEL3在喉癌筛查中具有较高的敏感度和特异度，表明YPEL3甲基化在喉癌早期诊断中具有更高的诊断价值。

参考文献：

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