肝肠钙粘连蛋白在反流性食管炎、Barrett食管和食管腺癌中的表达及意义

史丽芳 苏秉忠 李艳梅

Barrett食管（BE）是指食管贲门交界处的齿状线1 cm以上的食管鳞状上皮被化生的柱状上皮所替代，伴或不伴有肠化。BE是胃食管反流病（GERD）的一种类型，也是食管腺癌（EA）的主要癌前病变，其腺癌的发生率较正常人高30～50倍。从GERD、BE、不典型增生到EA的发病模式已被流行病学、组织学和分子生物学所证实。目前，多数学者认为BE伴有肠化生者属于EA的癌前病变，而BE不伴有肠化生的是否存在癌变风险尚不明确。

肝肠钙粘连蛋白（LI-cadherin）是近年来发现的一类只表达在老鼠肝肠系统的钙粘连蛋白新成员，是肠上皮细胞中一种Ca2+依赖性的贯穿于细胞膜、介导细胞间连接的糖蛋白。LI-cadherin在空间分布、结构和功能上与经典的钙粘蛋白不同，但在胚胎的发生、发育及组织器官的形成和结构的维持，以及细胞间、细胞与基质间的粘附和组织结构的维持方面扮演着重要角色。若其功能发生紊乱，细胞间的粘附作用将会降低，形态也会发生改变，致迁移性增强，接触性抑制作用减弱，从而促使一些肿瘤发生侵袭、转移[1]。LI-cadherin属于非经典钙粘蛋白超家族，有其独特的结构，与钙粘连蛋白超家族其他成员没有太多的同源性。另外，位于其氨基末端EC1的细胞粘附识别区（CAR）中的HAV序列由AAL序列替代，决定了细胞的粘附特性[2]。

研究显示，LI-cadherin在不同类型肿瘤中的表达存在差异。在EA表达呈现下降[3]，可能与肿瘤细胞的侵袭转移及淋巴结的转移有关。本研究通过检测肝肠钙粘连蛋白 （LI-cadherin）在反流性食管炎（RE）、Barrett食管（BE）、食管腺癌（EA）、胃黏膜肠化生（GIM）中的表达，以探讨BE和EA早期诊断的分子学标志物及BE伴肠化生（简称BE2）与GIM的关系。

资料和方法

一、一般资料

选自2013年8月至2014年12月就诊于内蒙古医学院附属医院的患者，主诉为烧心、反酸、胸骨后疼痛、吞咽困难或上腹不适等，进行胃镜检查以除外消化性溃疡等疾病。记录入选患者相关临床资料。经胃镜和（或）手术病理检查后，将患者分为以下7组：RE 组、BE1组 （BE 不伴肠化生）、BE2组、BE3组（BE伴不典型增生）、EA组（各30例）、GIM组及正常对照组（各20例），7组研究对象间性别及年龄比较均无统计学差异（P＞0.05）。

二、诊断及纳入标准

①RE诊断：采用洛杉矶分级法。②BE诊断：按2015美国胃肠病学会（ACG）的BE临床诊治指南。③EA诊断：位于GEJ以上的腺癌（取材前未经放化疗等抗肿瘤治疗）。④胃上皮肠化生：内镜下取胃黏膜组织经病理学证实者。

入组者要求不合并有其他严重基础疾病者，经常规检查未发现有可疑恶性病灶 （EA组要求无第二原发肿瘤），入组者均为单病种或患有不影响本实验结果的其他疾患。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

三、实验仪器及试剂

1.实验仪器

Olympus CX21光学显微镜、80-1台式电动离心机、-80℃超低温冰箱、酶标仪、全自动洗板机、液体快速混合器、微型混合器、隔水式电热恒温培养箱、微波炉、各型加样器。

2.实验试剂

兔抗人LI-cadherin一抗、羊抗兔共同二抗（北京博奥森生物技术有限公司）、PBS缓冲液、柠檬酸缓冲液、3%H2O2等。人LI-cadherin ELISA检测试剂盒（美国RD公司）等。

四、研究方法

1.标本留取

免疫组织化学法所需组织取自胃镜下和（或）外科手术，胃镜所取黏膜标本大小约2 mm×2 mm×1 mm，外科手术所取组织标本大小约1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm，标本均用10%甲醛溶液固定，低温包埋。

ELISA法所需血清取自入选者在门诊或入院次日晨采空腹肘静脉血2 mL，EDTA抗凝，标本在采集后30 min内置于4 000 rpm离心15 min，分离上清液（溶血者、脂血者弃去），置于-70℃保存，标本反复冻融不超过3次。

2.免疫组织化学SP法

EnVisionTM二步法免疫组织化学染色。

五、统计方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。计量资料以x±s或 M（Q1,Q3）表示，采用 F检验、t检验或秩和检验。计数资料以%表示，采用χ2检验；等级分类资料采用秩和检验。相关性分析选用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、LI-cadherin 在 RE、BE1、BE2、BE3、EA、GIM组织中表达

BE2、BE3组中的表达高于正常组、RE 组、BE1组和EA组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。BE2组与GIM组中的表达相似，差异无统计学意义（Z=-0.355，P=0.723）， 而GIM 组明显高于 BE1组，差异有统计学意义（Z=-2.711，P=0.007），见图 1、表 1。

图1 病理切片LI-cadherin免疫组化

表1 LI-cadherin在组织中的表达 [n（%）]

二、LI-cadherin 在 RE、BE1、BE2、BE3、EA、GIM血清中表达

BE1、BE2、BE3组中的表达高于正常组、RE 组、EA组，在BE2、BE3组中的表达高于BE1组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。BE2组与GIM组中的表达相似，差异无统计学意义（Z=-0.704，P=0.481），而GIM组明显高于BE1组，差异有统计学意义（Z=-3.378，P=0.001），见表 2。

三、LI-cadherin在组织和血清中的表达相关性分析

Spearman相关性分析显示，LI-cadherin血清中含量与组织中表达存在正相关关系 （rs=0.746，P=0.000），见图 6。

四、EA组织中LI-cadherin表达与临床病理特征的关系

EA组织中LI-cadherin在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的表达低于 Ⅰ+Ⅱ期，差异有统计学意义 （P=0.014），有淋巴结转移者的表达低于无淋巴结转移者，低分化者的表达低于高、中分化者，但差异无统计学意义，见表3。

表2 LI-cadherin在血清中的表达 M（Q1,Q3）

图2 ELISA实验测定LI-cadherin浓度时的标准曲线（y=3.9023x2+4.5503x-0.2579,R2=0.9955）

表3 EA组织中LI-cadherin表达与临床病理关系

五、EA血清中LI-cadherin表达与临床病理特征的关系

EA血清中LI-cadherin在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的表达低于Ⅰ+Ⅱ期，差异有统计学意义 （P＜0.001），有淋巴结转移者的表达低于无淋巴结转移者，低分化者的表达高于高、中分化者，但差异无统计学意义,见表4。

表4 EA血清中LI-cadherin蛋白表达与临床病理关系

讨 论

近年来GERD的发病率逐年上升，其并发症BE也随着上升。我国EA（约占食管癌的22%）的发病率有逐年上升的趋势。早期诊疗是提高EA治疗效果最为有效的方法。准确诊断BE，是降低EA发生的前提。目前内镜检查加病理活检仍是BE诊断的金标准，免疫组化染色已成为重要的辅助方法。需在加强内镜检查技术发展的同时，将标志物的研究提上日程。

LI-cadherin是Jaccobs实验室于1997年发现的钙粘蛋白家族中一员，正常情况下，其限制性的表达在极化的肠上皮细胞中（肝实质细胞、肠上皮细胞和杯状细胞），而在食管和胃黏膜上皮中不表达[4]。研究示：在正常食管黏膜及食管炎中无表达，在BE中表达增高，LI-cadherin可作为BE诊断的早期标志[5-6]。

本实验通过检测患者组织中的LI-cadherin表达情况，可以区别BE伴肠化生、BE伴不典型增生与正常食管黏膜、RE、BE不伴肠化生、EA。检测血清中的含量，尚可区别EA与BE不伴肠化生；提示运用ELISA法检测尚可区分BE不伴有肠化生与BE伴有肠化生。Weimann A等研究表明LI-cadherin在BE、不典型增生中表达逐渐上调，在轻度不典型增生及重度不典型增生中无明显差别，而在EA表达又趋下降[3]。本实验研究结果与其一致，其具体机制有待后续研究。同时本实验显示血清中的LI-cadherin含量与组织中表达存在正相关关系。故认为血清中的含量可以反映其组织中的水平，其有望作为检测BE、EA的生物学标志物。

已经证实GIM是胃癌的癌前病变。对于BE不伴有肠化生组与BE伴有肠化生组发展为EA的风险有无区别一直存在争议[7]。本实验显示通过检测LI-cadherin在组织中及血清中的表达及含量，可以区别BE伴有肠化生与BE不伴有肠化生，认为BE伴有肠化生可能与GIM的癌变一样，为癌前病变，而不支持BE不伴有肠化生是EA的癌前病变。

LI-cadherin在不同类型肿瘤中的表达存在差异。在EA中低表达或不表达[6]。本实验研究提示，检测EA患者LI-cadherin的表达情况及含量，可以区别其TNM的分期。但对于其有无淋巴结的转移及其分化程度与LI-cadherin的关系，尚需进一步研究；其表达情况及含量与患者的年龄、性别无关。

LI-cadherin在正常食管黏膜、RE表达较低，在BE不伴有肠化生、BE伴有肠化生、BE伴有不典型增生中逐渐增强，EA呈低表达或不表达，表明其功能发生紊乱，促使食管黏膜从正常逐渐进展为EA。

在EA的发生、发展过程中，促使、抑制肿瘤发生的因素是多重的，涉及众多分子之间的相互作用及与机体、环境之间的作用。本研究结果在一定程度上为EA的早期诊断提供组织学、血清学依据。

但本实验中纳入的EA例数较少，有待于后期大样本、双盲、多中心的研究，应用PCR法检测新鲜组织中LI-cadherin含量，从基因水平研究其变化与EA发生、发展的关系，寻找可能的分子生物学机制。进一步阐明BE伴有肠化生为EA的癌前病变，从而指导BE临床的诊治及随访。

[1]Takamura M,Yamagiwa S,Matsuda Y,et al.Involvement of liverintestine cadherin in cancer progression[J].Med Mol Morphol,2013,46(1):1-7.

[2]Bartolmäs T,Hirschfeld-Ihlow C,Jonas S,et al.LI-cadherin cisdimerizes in the plasma membrane Ca(2+)independently and forms highly dynamic trans-contacts[J].Cell Mol Life Sci,2012,69(22):3851-3862.

[3]Weimann A,Zimmermann M,Gross M,et al.CDX2 and LI-cadherin expression in esophageal mucosa:use of both markers can facilitate the histologic diagnosis of Barrett′s esophagus and carcinoma[J].Int J Surg Pathol,2010,18(5):330-337.

[4]Baumgartner W,Wendeler MW,Weth A，et al.Heterotypic traninteraction of LI-and E-cadherin and their localization in plasmalemmal microdomains[J].Mol Biol,2008,18;378(1):44-54.

[5]陈鑫,王邦茂,李麟,等.Cdx2、LI-CD和p63在Barrett食管中的表达及相互关系[J].中国肿瘤临床,2009,36(14):827-829,834.

[6]Weimann A,Rieger A,Zimmermann M,et al.Comparison of six immunohistochemical markers for the histologic diagnosis of neoplasia in Barrett′s esophagus[J].Virchows Arch,2010,457(5):537-545.

[7]Miao Q,Peng YS,Cai GH,et al.Comparison of intestinal metaplasia in gastric cardia and Barrett′s esophagus[J].Dig Dis,2011,12(4):272-278.