水稻黄绿叶基因Yellow-Green Leaf 6 (YGL6)的表达模式与蛋白定位

施军琼 王亚琴 张天泉 马 玲 桑贤春 何光华,*



水稻黄绿叶基因Yellow-Green Leaf 6 (YGL6)的表达模式与蛋白定位

施军琼1,2王亚琴1张天泉1马 玲1桑贤春1何光华1,*

1西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市重点实验室, 重庆 400716;2西南大学生命科学学院, 重庆 400716

叶色突变既可作为形态标记用于杂交稻育种, 又是研究光合系统的结构和功能、叶绿素生物合成及其调控机制的理想材料。EMS (ethyl methane sulfonate)诱变籼稻恢复系“缙恢10号”获得1个稳定遗传的黄绿叶突变体, 暂命名为(。前期我们通过图位克隆筛选出候选基因, 通过遗传互补实验证实了黄绿叶基因为, BLASTp分析表明基因编码NAD(P)-结合的Rossmann折叠超家族蛋白质, 属于短链脱氢酶/还原酶家族, 推断为异黄酮还原酶、糖脱水酶或mRNA结合蛋白。利用qRT-PCR进行表达模式的分析表明基因仅在绿色组织如心叶、成熟叶、叶鞘和绿色颖壳中表达, 尤其以心叶的表达量最高, 同时基因表达还受光照的诱导。构建亚细胞定位载体, 转水稻原生质体结果表明YGL6蛋白定位于叶绿体。本研究丰富了水稻突变体库, 为基因的功能分析奠定了基础。

水稻(); 黄绿叶;基因; 叶绿体; 表达模式

水稻叶色突变是比较常见的, 突变基因往往直接或间接影响叶绿素的合成和降解, 从而影响水稻光合作用, 造成植株减产甚至死亡。近年来, 大量研究结果显示, 叶色突变体是植物光合作用机制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的结构功能和遗传发育调控机理、作物标记性状等研究的理想材料[1-3]。

水稻叶绿素缺乏突变类型丰富, 目前已鉴定突变体90多个, 除第12染色体外, 其他染色体均发现了叶绿素缺乏突变基因(http://www.shigen.nig.ac. jp/rice/oryzabaseV4/)。虽然其大部分已被定位, 但仅少数被克隆, 它们分别参与叶绿素的生物合成、降解和叶绿体的发育[4,5-12]。叶色突变的机制复杂, 除叶绿素代谢和叶绿体发育引起外, 还有质-核信号转导途径受阻[13]、血红素的反馈调节紊乱[14]、光敏色素调控受阻[15]、叶绿体蛋白转运受阻[16]、ATP转运蛋白基因[17]等其他突变机制。随着新的水稻叶色突变体的发现, 叶色突变相关基因的分子机理研究将更加透彻。

叶绿体RNA结合蛋白是一类定位于叶绿体, 参与叶绿体RNA代谢的由核基因编码的蛋白。叶绿体RNA结合蛋白与细胞核或细胞质中的RNA结合蛋白具有类似的功能, 包括参与RNA的稳定和RNA转录后的加工过程等。此外, 叶绿体RNA结合蛋白对细胞核与叶绿体之间的信息传递和功能协调起重要作用。本研究利用EMS诱变恢复系缙恢10号, 从其后代中获得一份稳定遗传的黄绿叶突变体, 该突变体叶片在苗期呈黄绿色, 分蘖后期至成熟期转为淡绿色。图位克隆及测序结果表明为候选基因, 遗传互补实验证实黄绿叶基因为。根据gramene网站(http://www. gramene.org/)提供的信息, YGL6蛋白属于RNA结合蛋白类, 利用qRT-PCR分析表明基因仅在绿色组织如心叶、成熟叶、叶鞘和绿色颖壳中表达, 并受光照条件的诱导。构建与的融合表达载体转化水稻原生质体发现YGL6与GFP的融合蛋白定位于叶绿体, 因此YGL6极有可能是叶绿体中的RNA结合蛋白, 并参与了水稻叶绿体的发育过程。本研究初步揭示了的基因功能, 为进一步研究奠定了基础, 并丰富了水稻突变体库, 深化了当前对叶绿体发育过程的研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黄绿叶突变体由EMS诱变缙恢10号 (Jinhui 10)所得, 经多代培养已遗传稳定。缙恢10号是西南大学水稻研究所选育的优良籼稻恢复系, 以其作为野生型对照。

1.2 基因组互补载体的设计、构建与转化

由于pCAMBIA1301上的单酶切位点在基因的基因组DNA序列均存在, 并且扩增片段较长, 则采用重组酶的方法进行。引物6HBF1和6HBR2分别与载体pCAMBIA1301H I和d III酶切后的片段有15 bp的重叠; 引物6HBR1和6HBF2有15 bp的重叠用于连接前后2个扩增片段的重叠片段。引物6HBF1、6HBR2、6HBF2、6HBR1的序列分别为5¢-cggtacccggggatcAACATGGTCAGGCACA GTGATGAGAT-3¢、5¢-AGATAGGAGATGGTAGCAG GAGGCTG-3¢、5¢-TACCATCTCCTATCTCTGACTTC AGTAGTGC-3¢和5¢-GGCCAGTGCCAAGCTGGTC AAGCTCCCTGGTGAGGCTAT-3¢。载体参照Shi等[18]的方法构建与转化。

1.3 YGL6蛋白的进化分析

参照Ren等[19]的方法分析YGL6蛋白的进化。

1.4 基因表达分析

参照Shi等[18]的方法进行RNA的提取和纯化、cDNA的合成和qRT-PCR的表达分析。

1.5 光合色素含量的测定

以野生型、突变体和互补植株为材料, 上午9:00在种植小区中间随机选择长势相对一致的5个单株, 测定叶片中部的光合色素含量。称取0.1 g叶片剪碎装入离心管, 加25 mL丙酮∶无水乙醇(1∶1, v/v) 混合液封口暗处理24~48 h, 其间经常摇动, 每个样品重复3次。用分光光度计测定470 nm、645 nm和663 nm的光吸收值, 参考Lichtenthaler[20]的方法计算。

1.6 亚细胞定位

选择载体pTCK303为载体骨架, 其上的Ubiquitin为启动子,H I和I为双酶切位点。设计引物扩增基因的整个CDS片段, 前引物ATG前加入来自pTCK303H I酶切后Ubiquitin侧15 bp, 后引物不含终止密码子。再设计1对引物扩增基因的整个CDS片段, 前引物与的后引物有15 bp的重叠, 后引物加入来自pTCK303I酶切后NOS侧15 bp碱基。引物6OEPF1、6OEPR1、6GFPF1和6GFPR1的序列分别为5¢-tacttc tgcaggatcATGGCAGCAACAGCCTCCCT-3¢、5¢-tcacc atgacgctgaCGAGCTTCTTGCC-3¢、5¢-tcagcgtcatggtga GCAAGGGCGAGGA-3¢和5¢-CAAATGTTTGAAC GGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3¢。参照Ren等[19]转水稻原生质体的亚细胞定位方法。

2 结果与分析

2.1 YGL6基因组互补验证

为了验证通过图位克隆筛选出的候选基因就是基因[18], 构建了基因组互补载体, 将野生型中基因组片段包括上游3500 bp、编码框和下游1500 bp序列利用重组酶整合到pCAMBIA1301表达载体中, 然后通过农杆菌介导法遗传转化突变体。在T0获得的转基因植株中, 共观察到12株转基因植株的突变体表型得以恢复(图1-A, B)。同时通过提取DNA后测序比对发现, 12株转基因植株在突变位点均出现了双峰, 证实互补载体成功转入突变体, 使其表型得以恢复正常(图1-C)。分析表明恢复表型的转基因植株的叶绿素、叶绿素和类胡萝卜素含量均达到了野生型的色素含量水平(图1-D)。

图1 YGL6基因的互补验证

A: WT、和转基因互补植株; B: WT、和转基因互补植株的叶片; C: WT、和转基因互补植株突变位点的测序结果; D: WT、和转基因互补植株的色素含量。*表示在0.05水平上差异显著。

A: phenotypes of WT,mutant,and transgenic plant (/); B: leaves of WT,mutant, and transgenic plant; C: thesequencing of WT,mutant, and transgenic plant; D: pigment contents of WT,mutant, and transgenic plant. *﹤0.05.

2.2 YGL6蛋白质功能注释与进化分析

通过比对水稻基因组序列, 在其他位置未发现与基因高度相似的序列, 表明基因是单拷贝基因。利用NCBI网站对YGL6蛋白质BLASTp分析表明,基因编码NAD(P)-结合的Rossmann折叠超家族蛋白质, 属于短链脱氢酶/还原酶家族, 推断为异黄酮还原酶、糖脱水酶和mRNA结合蛋白等。YGL6蛋白质具有多个保守结构域, 如SDR-a1结构域、NAD(P)-结合位点、UDP-葡萄糖-4-异构酶C末端亚基、短链脱氢酶、RNA结合蛋白、NAD依赖的异构酶家族等。

YGL6蛋白在网站gramene (http://www.gramene. org/)预测是一个RNA结合蛋白, 生物信息学分析该蛋白质定位于叶绿体, 系统进化树分析表明其与其他物种的叶绿体茎环结合蛋白聚类在一起。从系统进化中可以看出, 该基因属于高保守低拷贝, 从藻类、苔藓到高等植物均含有此蛋白, 并且藻类、苔藓、单子叶和双子叶植物各自组成一个分支(图2)。

2.3 YGL6基因的表达分析

通过qRT-PCR检测,基因在苗期除根外, 心叶、成熟叶和叶鞘中均有表达, 尤以心叶的表达量最高, 达到成熟叶的6倍多(图3-A); 在孕穗期, 仅在叶片和叶鞘中有表达, 在心叶的表达量最高; 在抽穗期的绿色颖壳中也有表达(图3-B)。以上结果表明基因在整个生育期的绿色部位表达, 尤以心叶的表达量最高。

2.4 YGL6基因表达受光照的影响

对连续暗培养14 d的水稻幼苗光照处理表明, 随着光照时间的延长,基因的表达量不断上升(图4-A)。对连续光培养14 d的水稻幼苗进行黑暗处理表明暗培养0.5 h表达量下降, 但随后表达量逐渐上升, 在4 h时达到最大表达量, 随后逐渐下降, 在24 h时降到最低表达量(图4-B)。以上结果表明基因的表达受光照的诱导。

图2 YGL6基因的进化分析

图3 YGL6基因表达分析

A: 苗期基因在WT和的表达分析; B: 孕穗期基因在WT的表达分析。*表示在0.05水平上差异显著。

A: expression level ofat seedling stage in WT and themutant; B: expression level ofat booting stage in WT. *﹤0.05.

2.5 YGL6蛋白的亚细胞定位

亚细胞定位分析网站(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)预测YGL6蛋白定位于叶绿体, 为了验证YGL6蛋白是否定位于叶绿体, 构建了35S-ORF-GFP和35S-GFP融合瞬时表达载体。将瞬时表达载体转化水稻原生质体, 用绿色荧光蛋白GFP做指示。结果表明, 在转35S-GFP原生质体, 除液泡外绿色荧光信号在整个细胞中均能观察到(图5-A~D); 而在转35S-ORF-GFP的原生质体中, GFP的绿色荧光信号(图5-E)和叶绿体自发的红色荧光信号(图5-F)重叠为黄色(图5-H), 说明YGL6蛋白定位在叶绿体。

3 讨论

在众多被鉴定的叶色突变体中, 仅有少数基因被克隆。叶绿素生物合成和叶绿体发育是一个相当复杂的过程, 目前已克隆的水稻叶色突变基因直接或间接影响叶绿素代谢或者叶绿体的发育。直接参与编码叶绿素合成与降解的酶基因有编码镁离子螯合酶H、D和I亚基的[7]、和[11]基因, 叶绿素酸酯氧化酶基因、[8], 叶绿素合成酶基因[12]。调控叶绿体发育的基因有鸟苷酸激酶基因[9-10], 三角状五肽重复蛋白基因[21], 叶绿体RNA聚合酶基因[22]等。此外已成功克隆出的叶色相关基因还有持绿突变体基因()[23], 叶绿素还原酶基因()[24], 叶绿素还原酶的同源基因[25]等。通过图位克隆和基因互补实验表明基因是一个位于第12染色体的SDR超家族基因, 虽然目前已发现的叶色突变相关基因有90多个, 但在第12染色体鲜有叶色突变的报道, Shi等首次报道了突变体[18], 本研究证实了是一个调控叶色突变的基因。

图4 光照对YGL6基因表达的分析

A: 连续黑暗培养后在不同光照时间基因的表达; B: 连续光照培养后在不同黑暗时间基因的表达。

A: expression level ofin wild-type plants at different hours transferred to continuous light from continuous darkness; B: expression level ofin wild-type plants at different hours transferred to continuous darkness from continuous light.

图5 YGL6蛋白的亚细胞定位

A~D: 阴性对照(35S-GFP); E~H: YGL6蛋白定位(35S-ORF-GFP)。

A-D: negative control (35S-GFP); E-H: subcellular location of YGL6 protein (35S-ORF-GFP).

最近有研究表明, 叶绿体有不同的RNA池, 其中有些RNA被翻译, 而其他的并不被翻译[26]。细菌RNA转录后即被翻译, 剪切、RNA编辑、内含子剪接等转录后加工在细菌中较少存在[27]。然而, 叶绿体的初级RNA产物均需要不同形式的转录后加工[28]。细菌的多顺反子直接进行翻译, 而叶绿体的多顺反子需要进一步剪切产生更小的多顺反子或单顺反子RNA, 有些还需要进一步的剪切或编辑产生成熟的RNA[28-29]。多数质体RNA的成熟需要低特异性的核酸酶, 加工的程度通常由RNA结合蛋白和RNA的二级结构决定[28-29]。叶绿体RNA代谢需要数量众多的RNA结合蛋白的参与, YGL6具有mRNA结合结构域, 亚细胞定位结果显示YGL6蛋白定位于叶绿体。综合上述结果可以确定基因是一个新的调控水稻叶绿体RNA代谢的基因, 有助于更进一步理解和完善水稻叶色突变的机制。

利用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对YGL6蛋白质BLAST分析表明,基因编码NAD(P)-结合的Rossmann折叠超家族蛋白质, 属于一个短链脱氢酶/还原酶家族 (short-chain dehydrogenase/reductase, SDR), 多数被鉴定的SDR被推断为异黄酮还原酶、糖脱水酶和mRNA结合蛋白等。Baker等研究表明菠菜一个mRNA结合蛋白CSP41和核苷-糖异构酶及羟类固醇脱氢酶同源[30]。CSP41是一类分子量为41 kD的叶绿体茎环结合蛋白, 目前已对多个物种的CSP41进行了克隆和功能分析。最早报道的CSP41a在体外可以结合到mRNA的3¢末端, 具有序列特异的茎环结构结合能力和核酸内切酶活性[31]。随后研究表明, CSP41蛋白也在质体编码的RNA PEP (plastid-encoded polymerase)或者质体核糖体中存在, 可能参与RNA的转录或翻译过程[32-33]。但最近的研究却不能证实CSP41是PEP复合物的一部分[34]。研究表明CSP41缺乏已知的核酸内切酶基序, 但属于SDR超家族, 实验表明SDR基序可能是新类型的核酸内切酶基序[35]。CSP41的蛋白功能具有多样性, 并且已报道的CSP41蛋白均来自其他物种, 在水稻中尚无报道。水稻究竟行使以上的哪种或哪几种功能, 还是其他的未知功能, 以及YGL6蛋白质是否为CSP蛋白, 需要进一步的相关实验探究。

4 结论

黄绿叶基因为, 与其他物种的叶绿体茎环结合蛋白聚类在一起。基因仅在绿色组织如心叶、成熟叶、叶鞘和绿色颖壳中表达, 尤其以心叶的表达量最高, 其表达还受光照的诱导。YGL6蛋白被定位于叶绿体。我们认为通过蛋白产物的RNA结合功能参与叶绿体的发育过程。本研究为进一步研究的基因功能奠定了基础, 并丰富了水稻突变体库, 深化了当前对叶绿体的发育过程的研究。

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Expression Pattern and Protein Localization of a() Gene in Rice ()

SHI Jun-Qiong1,2, WANG Ya-Qin1, ZHANG Tian-Quan1, MA Ling1, and HE Guang-Hua1,*

1Rice Research Institute, Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Southwest University, Chongqing 400716, China;2School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400716, China

Leaf color mutants are used not only as morphological markers in hybrid rice breeding, but also as ideal materials in studies on the structure and function of photosystem, chlorophyll biosynthesis and regulation mechanism. A new rice mutant exhibiting stable inheritance was derived from ethyl methane sulfonate (EMS)-treated restorer line Jinhui 10 (), tentatively named as(). Theleaf displayed yellow-green at seeding stage, and pale green at jointing stages. The YGL6complementation experiment implied that theis thegene. The expression pattern analysis indicated thatwas expressed in green tissues including young leaves, mature leaves, sheaths and green glume, with the highest expression level in young leaves. Andexpression was induced by light. Transient expression of theYGL6-GFP protein in rice protoplast showed that YGL6 was localized in chloroplasts. These results provide a foundation for functional analysis of.

rice ();();gene; chloroplast;expression pattern

2017-09-23;

2018-01-08;

2018-01-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.00650

本研究由科技部重点研发计划项目(2017YFD0100201), 重庆市科委项目(CSTCCXLJRC201713, cstc2016shms-ztzx0017)和中央高校基本业务费专项(XDJK2016C111)资助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0100201), Chongqing Science and Technology Commission Project (CSTCCXLJRC201713, cstc2016shms-ztzx0017), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2016C111).

何光华, E-mail: hegh@swu.edu.cn

E-mail: shijunqiong@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180126.1647.024.html