胶质瘤中PTB调控长非编码RNA选择性剪接的筛选

卫群芳，朱丽媛，韩 为，彭小忠

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系，北京 100005)

多聚嘧啶区结合蛋白(polypyrimidine-tract-binding protein，PTB) 是一种多功能RNA结合蛋白，其在转录后调控中发挥重要功能。研究表明，PTB通过调控免疫因子或代谢通路中关键基因(FGFR1[1]、USP5[2]、PKM[3]和MARK4[4])的选择性剪接影响胶质瘤细胞的多个过程。然而PTB是否调控长非编码RNA的选择性剪接尚未有明确认知。

长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)是一类长度大于200 nt、无编码蛋白能力的转录本。LncRNAs的转录后加工与mRNA相似，其转录过程需要RNA聚合酶Ⅱ参与，存在多聚腺苷酸化现象，通过典型剪接位点(GU和AG)发生剪接加工[5]。

在胶质瘤背景下，本研究旨在探究PTB参与长非编码RNA选择性剪接的动态变化，为探索PTB调控长非编码RNA选择性剪接机制提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本与细胞系：人胶质瘤病例样本组织(北京天坛医院神经外科)，采集前均经北京天坛医院医学伦理学委员会批准并取得所有涉及此项研究患者的同意，所有胶质瘤病例均经组织病理学检查证实为胶质瘤。人正常脑组织样本(北京协和医学院遗体捐献者脑组织)。人正常星形胶质细胞(HA)(ScienCell公司)；人神经胶质母细胞瘤(U87MG、T98G、U118MG、LN18和LN229)(美国ATCC公司)；人神经胶质母细胞瘤(SF126)(中国医学科学院基础研究医学研究所细胞中心)。

1.1.2 主要试剂：Trizol (Invitrogen公司)；EasyScript First Strand cDNA Synthesis试剂盒(全式金生物技术公司)；SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)；INTERFERinTM(Polyplus公司)；Affymetrix HTA 2.0芯片(Affymetrix 公司)。

1.2 方法

1.2.1 芯片数据建立：所用芯片为 Affymetrix HTA 2.0芯片,完成 16个样本检测和分析。采用的样品包括人胶质瘤组织(n=3)和胶质瘤细胞系(T98G,U87MG,U118MG)；正常人脑组织(n=3)和正常胶质细胞系(HA)；敲低PTB细胞株U87MG(n=3)和对照组(n=3)。样品总RNA利用NanoDrop ND- 2000(Thermo Scientific公司)定量并经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies公司)检测RNA完整性。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程(上海欧易有限公司完成)。

1.2.2 芯片数据分析：分析使用的软件为Transcriptome Analysis Console软件(version1.0, Affymetrix公司)。差异外显子或者连接处(junction)利用One-Way Between-Subject ANOVA(Unpaired公司) 分析得到的差异显著性P值和Splice index进行筛选。筛选的标准为首先消除背景信号，即DABG(detection above background)<0.05,根据剪接指数Splice index>2.0或者Splice index <-2.0且P值≤ 0.05进行过滤。筛选过程：建立两个比较组，分别为肿瘤组(肿瘤细胞组织vs正常细胞组织)和敲低组(敲低PTB细胞vs对照组)，根据前述筛选标准进行初筛，而后根据软件数据库标注信息选择非编码基因，对两组非编码基因取交集得到候选基因。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测候选长非编码RNA异构体表达： 常规Trizol法提取总RNA。为防止基因组干扰非编码RNA检测，需加DNaseI 消化去基因组步骤，再抽提一遍RNA。使用全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒，按照说明书进行操作。实时荧光定量PCR使用TaKaRa公司的SYBR预混试剂及Bio-Rad定量PCR仪进行检测。结果的统计学处理：计算同一个样品目的基因的Ct值与GAPDH的Ct值比值，取3个平行孔Ct比值的平均数，按2-ΔΔCt计算为样品的相对表达值。针对16个候选基因的转录本异构体特异区域设计引物，实时荧光定量 PCR检测候选非编码RNA异构体在组织样本和细胞系中的表达。

1.2.4 核质分离：采用核质分离(NE-PER)试剂盒，根据说明书对胶质瘤细胞T98G胞质和胞核的RNA进行提取分离、提取。β-actin作为胞质组分阳性对照，Malat1作为胞核组分阳性对照。实时荧光定量 PCR检测目的基因linc00882剪接异构体的亚细胞定位。实时荧光定量 PCR引物(引物位置示意图见图1)：linc00882-L正向:5′-GTTAGGGACGCG CATGAAAT-3′,linc00882-L反向:5′-GCCACATGTG TTTGCCAGAT-3′, linc00882-S正向:5′-GAGCACC CTGATCTTCCACT-3′, linc00882-S反向：5′-CTGCCA TGTGACATCTCAGC-3′。

图1 Linc00882剪接异构体外显子组成及引物位置示意图Fig 1 Diagram of exon composition of linc00882 splicing isoforms and primer location

1.2.5 T98G细胞转染siRNA敲低PTB：根据INTERFERinTM说明书将PTB-siRNA转染至T98G细胞，转染步骤及体系根据使用说明书进行(PTB特异性siRNA序列：PTB-siRNA1：AGAAGGACCGCA AGAUGGCACUGAU；PTB-siRNA2：ACCGCAAGAUG GCACUGAUCCAGAU)。转染48 h后提取蛋白和总RNA。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 芯片分析结果

肿瘤组织样品和细胞与正常组织样品和细胞比较，有4 947个基因符合条件，其中有308个基因注释为非编码基因；敲低组与对照组比较，有1 191个基因符合，其中59个注释为非编码基因；两个比较组的非编码基因取交集(图2)，得到16个神经胶质瘤中受PTB调控的具有选择性剪接的非编码基因为候选基因(表1)。

2.2 实时荧光定量PCR验证候选长非编码RNA异构体的表达

Linc00882在组织样本和细胞系中表达一致。相对于正常组织和细胞，短的异构体(命名为linc00882-S)在肿瘤组织和细胞中低表达，长的剪接异构体(命名为linc00882-L)在胶质瘤中显著低表达。linc00882-L/S比值在肿瘤组中均小于正常组(图3)。

2.3 T98G细胞中敲低PTB导致剪接异构体转换现象

与对照组相比，linc00882-S和linc00882-L在敲低PTB后表达均上调，而linc00882-L上调更明显；linc00882-L/S比值在敲低PTB后上调(图4)。

2.4 检测linc00882异构体核质分布

胞质分布的阳性对照β-actin mRNA在胞质组分含量大于90%，胞核分布的MALAT1长非编码RNA在胞核组分含量大于80%。linc00882两条异构体在胞质组分含量均大于90%(图5)。

DABG: detection above background; Splicing Index shows the normalized fold change of Condition1vs. Condition2：2[Condition1 Normalized Avg Signal (log2) - Condition2 Normalized Avg Signal (log2)]

图2胶质瘤中PTB介导的选择性剪接非编码基因的筛选
Fig2ScreeningPTB-mediatenoncodingRNAsplicingtargetsonglioblastoma

表1 芯片筛选出的16个候选非编码基因列表Table 1 List of candidate noncoding RNAs through array screening

A.real-time PCR analysis of linc00882 isoforms in normal brain cell lines(n=1) and glioma cell lines(n=6). GAPDH was chosen to be internal control; B.ratio of isoforms between linc00882-L and linc00882-S in normal brain cell lines and glioma cell lines; C.real-time PCR analysis of linc00882 isoforms in normal brain tissue samples (n=4) and glioma tissue samples (n=7), GAPDH was chosen to be internal control;D.ratio of isoforms between linc00882-L and linc00882-S in normal brain and glioma tissue samples

图3Linc00882剪接异构体在组织和细胞系中的表达及比值

Fig3Relativeexpressionoflinc00882isoformsintissuesamplesandcelllinesandratiobetweenisoforms

A:PTB expression was detected in protein level by using Western blot; B:real-time PCR analysis the changes of linc00882 isoforms following PTB-knock down in T98G cell(n=3),*P<0.05,**P<0.01 compared with corresponding control cells (Student’s t test)， GAPDH was chosen to be internal control; C：changes of the linc00882 isoforms ratio followed by following PTB knocking down in T98G cells

图4敲低PTB回复linc00882剪接异构体的表达

Fig4Expressionandratiooflinc00882isoformsarerescuedfollowingPTB-knockdown

The subcellular location of different linc00882 isoforms were identified using nucleic/cytoplasm component isolation; β-actin was used as the positive control of cytoplasm expression genes，while Malat1 was the nucleic one

3 讨论

据统计，大约95%的人类多外显子基因涉及选择性剪接[7]。长非编码RNA领域的研究一步步深入，而选择性剪接方面的研究报道尚少。全转录组芯片(Affymetrix HTA 2.0)的特点是在外显子连接处设计探针，结合外显子的表达信号和各方面数据库信息，组合计算出不同的剪接异构体形式及表达丰度。

本研究筛选出受PTB影响的16条候选非编码基因并确定目的基因linc00882。选择性剪接调控使得前体RNA的不同剪接异构体在特异细胞中的表达比例发生转变，称为“异构体转换”现象[5]。长非编码RNA linc00882剪接类型为3′端选择性剪接。Linc00882表达检测实验说明linc00882可能有抑制肿瘤作用。PTB蛋白是一类重要的选择性剪接调控蛋白且在神经胶质瘤中高表达。敲低PTB实验说明linc00882两剪接异构体尤其是linc00882-L的表达可能受PTB蛋白影响。linc00882-L/S比值变化说明两条异构体在敲低前后的表达模式改变。综上，剪接异构体linc00882-L和linc00882-S二者表达模式变化受到PTB蛋白的影响，linc00882长非编码RNA在胶质瘤中可能发生异常剪接。据研究，PTB蛋白通常结合多聚嘧啶区，与剪接因子U2AF65结合序列有重叠[8- 9]。 PTB参与5′端选择性剪接类型调控，通过置换BCL-X 外显子2近端5′剪接位点上的剪接因子SRSF1，导致远端5′剪接位点的选择，产生BCL-Xs剪接异构体[10]。推测PTB蛋白可能与linc00882的3′端剪接位点上的剪接因子相互作用，通过协调或拮抗导致末端的剪接，产生或长或短的异构体。长非编码RNA不同剪接异构体可发挥不同的生物学功能。研究报道，剪接因子MBNL3调控lncRNA-PXN-AS1的选择性剪接，产生4号外显子跳跃或包含的剪接异构体。其中，外显子包含异构体结合PXN mRNA 3′UTR保护其不被miR- 24-AGO2复合物降解，外显子跳跃异构体结合PXN mRNA抑制翻译[11]。此外，linc00882两条剪接异构体的在胞质定位为后续功能研究提供了线索。本研究数据提示PTB蛋白可能调控长非编码RNA的选择性剪接，其具体机制仍需深入探究。

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