低氧微环境下胶质瘤干细胞表型的改变与RNA结合蛋白相关

李珊珊，胡佩珊，韩 为，彭小忠

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系 医学灵长类研究中心 神经科学中心，北京 100005)

胶质瘤是一种恶性程度高、致死率高、中位生存期短的恶性肿瘤，其发病位列全球前10位，具有放化疗抵抗、预后较差等问题[1]，给患者带来极大痛苦。胶质瘤干细胞是从胶质瘤中分离出来的具有无限增殖能力和分化能力的一类细胞[2]，胶质瘤干细胞的存在是导致胶质瘤难治愈性的主要原因之一。低氧是胶质瘤微环境的主要特征之一，低氧环境诱导低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)的产生，进而调控下游多种蛋白的表达[3]，影响胶质瘤干细胞的增殖能力和肿瘤球形成能力。

多种研究表明，RNA结合蛋白作为一类重要的调控蛋白，与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭有着密切关系[1]。因此，探究RNA 结合蛋白和胶质瘤干细胞微环境的关系意义重大，能够将胶质瘤发生发展的两个重要的环节相连，为进一步深入了解和治疗胶质瘤提供理论基础[4]。本研究拟通过建立胶质瘤干细胞的低氧微环境，探讨多种RNA结合蛋白的变化情况。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞系：GSC5 组织来源胶质瘤干细胞、U87MG-SLC细胞系来源的胶质瘤干细胞(均由本实验室分离得到)。

试剂：neurobasal 培养基和B- 27 添加剂(Gibco公司)；EGF和FGF (Pepro Tech公司)；肝素、Accutase酶、抗β-actin、hnRNPF、HuD抗体(Sigma公司)；L-谷氨酰胺(HyClone公司)；MTS试剂(Promega公司)；抗HIF- 1α 、SOX2、GFAP、Tuj1、ADAR1、CIRP和eEF1A抗体(Abcam公司)；抗Nestin、 EBP1抗体(Millipore公司)；抗PCBP2抗体(奥维亚公司)；抗UNR抗体(ABclonal公司)；抗hnRNPK、PCBP1抗体、抗UNRIP抗体(Santa Cruz公司)；抗PTBP1抗体由实验室自制；抗PTBP2抗体(Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 胶质瘤干细胞的培养：采用neurobasal培养基( 20 μg/L bFGF、20 μg/L EGF、10 mmol/L 肝素、2% B27和2 mmol/L L-谷氨酰胺)培养胶质瘤干细胞。无菌条件下，将悬浮的胶质瘤干细胞收集到15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，去掉上清后，加入Accutase 酶进行消化，37 ℃ 5 min，吹打均匀，1 000 r/min离心5 min去掉酶，加入培养基重悬细胞，吹匀后接种至10 cm培养皿中，每2～3 d传代1次。

1.2.2 低氧处理及实验分组：将复苏的胶质瘤干细胞传1代后分为低氧组和常氧组，低氧组(体积分数1%O2+5%CO2+94%N2)，常氧组(体积分数5%CO2+95%空气)，每2～3 d传代1次。

1.2.3 MTS检测细胞增殖：将MTS试剂和PMS试剂按照20∶1比例混合均匀，96孔板每孔加入20 μL，培养箱中孵育2 h后，检测490 nm和630 nm处的吸光度值。

1.2.4 肿瘤球形成实验：将胶质瘤干细胞按照上述步骤进行消化，吹打成单个细胞，加入1 mL培养基，台盼蓝计数，按照800个细胞/孔接种在96孔板中，每孔100 μL培养基，1～2周内统计肿瘤球数目和直径。

1.2.5 Western blot检测蛋白含量：将细胞收集至15 mL离心管中，0.9% NaCl溶液洗1次，转移至1.5 mL离心管，加入蛋白裂解液重悬细胞并吹打，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清加入蛋白上样缓冲液后，98℃金属浴10 min。进行SDS-PAGE分离后，电转至PVDF膜。5%牛奶封闭1 h，加入抗目标蛋白抗体(一抗)4 ℃过夜，第2天TBST洗涤10 min×3次，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗涤10 min×3次，暗室显影。

2 结果

2.1 低氧微环境抑制肿瘤干细胞U87MG-SLC的生长

与常氧组相比，低氧组胶质瘤干细胞U87MG-SLC的增殖能力显著受到抑制(P<0.05)(图1)。

2.2 低氧微环境促进胶质瘤干细胞的肿瘤球形成能力

与常氧组相比， 低氧组胶质瘤干细胞U87MG-SLC和GSC5的肿瘤球形成能力显著增强，肿瘤球数量和大小均显著高于常氧组(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with normoxia group

2.3 低氧微环境引起U87MG-SLC 中HIF和干性标志物的变化

低氧环境下，低氧诱导因子HIF- 1α显著上调(P<0.01)；干性标志物nestin和SOX2表达明显上调(P<0.01；P<0.05)；分化标志物 Tuj1没有明显变化，而GFAP表达明显上调(P<0.05)(图3)。

2.4 低氧微环境引起U87MG-SLC中RNA结合蛋白的表达水平变化

与常氧组相比，低氧组胶质瘤干细胞的多种RNA结合蛋白表达水平发生变化。 hnRNPF、UNRIP和HuD表达明显上调(P<0.05)；PCBP2和UNR表达明显下调(P<0.01；P<0.05)；多种RNA结合蛋白(hnRNPK、ADAR1、PCBP1、CIRP、EBP1、eEF1A、PTBP1和PTBP2)表达水平没有显著性变化(图4)。

3 讨论

低氧环境是肿瘤发生发展过程中一个重要的调节元素，低氧能够抑制多种实体瘤的增殖，促进侵袭等过程[5]。低氧引发的下游通路研究一直是一个研究热点，低氧引起HIF的产生，HIF进而促进多种基因的转录，表达多种蛋白以应对低氧环境。其中RNA结合蛋白与RNA结合后，能够影响RNA稳定性、翻译、剪接和运输，发挥着重大作用。

本研究着重于低氧下RNA结合蛋白这类群体对于胶质瘤干细胞的调控。已有研究表明，RNA结合蛋白PCBP2对于胶质瘤细胞的增殖有着非常重要的作用和功能[6]。国内外也有多项研究表明RNA结合蛋白作为一类重要的调节蛋白，对胶质瘤有着重要功能。如RNM14能够提高胶质母细胞瘤的化疗抵抗作用[7]，而RNA结合蛋白对于胶质瘤干细胞的功能研究尚不清晰。本研究检测了低氧下表达水平发生变化的5种RNA结合蛋白：hnRNPF、 UNRIP、 HuD、 PCBP2和UNR。业已报道，hnRNPF在胶质瘤细胞中是miR- 128的靶点，可能与miR- 128发挥抑制细胞增殖的作用相关[8]。HuD蛋白与果蝇胚胎致死异常视觉家族(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)高度同源，被认为与神经发育相关[9]。UNR与胶质瘤的关系尚未见报道。

*P<0.05 ，**P<0.01 compared with normoxia group图2 低氧微环境促进GSC5和U87MG-SLC肿瘤球形成能力Fig 2 Hypoxia microenvironment promoted the tumorspheres formation of GSC5 and

*P<0.05，**P<0.01 compared with normoxia group图3 低氧微环境引起U87MG-SLC中HIF- 1α、干性标志物和分化标志物的变化Fig 3 Hypoxia microenvironment induced changes of the expression of HIF- 1α,stemness markers and differentiation

*P<0.05，**P<0.01 compared with normoxia group图4 低氧微环境引起U87MG-SLC多种RNA结合蛋白水平的变化Fig 4 Hypoxia induced changes of the expression of RNA binding proteins in

肿瘤干细胞的干性表型与RNA结合蛋白密切相关。作为干细胞，肿瘤干细胞与组织干细胞相似，依赖多种信号途径维持干性。如Notch信号通路，RNA结合蛋白Musashi- 1能够促进Notch信号通路的活性，这主要是通过抑制Notch通路负性调节元件Numb完成的[10]。而RNA结合蛋白LARP4B则作为一个抑癌候选基因，在胶质瘤干细胞中显著下调[11]。另外，还有多种RNA结合蛋白在胶质瘤干细胞中发挥着重大功能，如IMP2通过miRNA let- 7调节胶质瘤干细胞干性表型[12]。由此可以看出，RNA结合蛋白与胶质瘤干细胞确实密切相关，其具体机制还需要深入探索。

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