迷迭香提取物对小鼠学习记忆能力的影响

向安萍 冯华 滕淑静 宋旭日

迷迭香[1]（Rosmarinus officinalis L.）是一种唇形科迷迭香属植物，全草可入药，味辛性温，具有健胃、安神的功效。早在2000多年前的欧洲，迷迭香被用来增强记忆力、改善语言障碍；饮用迷迭香茶可提神醒脑，提高注意力。本实验拟研究迷迭香提取物对小鼠学习记忆能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供的昆明种小鼠180只，雌雄各半，清洁级，平均体质量（20±3）g。

1.1.2 药物与主要试剂 迷迭香由平江香草公司提供，采用水蒸气蒸馏和溶剂萃取法[2]制备迷迭香精油、迷迭香水溶性提取物和迷迭香脂溶性提取物；氢溴酸东莨菪碱注射液（上海禾丰制药有限公司），规格为1ml: 0.3mg；盐酸吡硫醇片（脑复新，上海新亚药业有限公司）；生理盐水（贵州天地药业有限责任公司）。

1.1.3 仪器 DT- 200跳台自动测试仪（上海益联科教设备有限公司）、ZH-500x型小鼠避暗仪（安徽正华生物仪器设备有限公司）；BW- MYM103型Y迷宫（上海软隆科技发展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 小鼠适应性饲养1周，随机分为3组，每组60只，准备分别用于跳台实验、避暗实验和Y迷宫实验。每组60只小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性药组及迷迭香精油组、水溶性提取物组和脂溶性提取物组（n=10）。

1.2.2 给药 各组在实验前均进行6d的适应性训练，第7天给药：空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水，阳性药组灌胃脑复新100mg/kg，试药组分别灌胃迷迭香精油、水溶性提取物和脂溶性提取物200mg/kg，连续14d；末次给药后1h除空白对照组腹腔注射等量的生理盐水，其余各试验组均腹腔注射东莨菪碱3mg/kg[3]，20min后进行各项实验。

1.2.3 跳台实验 将小鼠先放入反应箱内适应3min，然后通36V交流电。动物在受到电击时的正常反应是跳回平台从而躲避伤害性刺激。但多数动物可能再次或多次跳下平台到铜栅上，受电击后又快速跳回平台。记录小鼠受到电击的次数即为错误次数，如此训练5min，作为学习成绩。24h后再进行测试，记录小鼠第一次跳下平台的时间即为潜伏期和5min内的错误次数。

1.2.4 避暗实验 将小鼠放入避暗仪的明室，明暗室间的圆洞打开，让小鼠自由穿梭于明暗室适应3min；测试时暗室通电（36V），小鼠背对洞口放入明室，进入暗室受到电击，正常反应为返回明室，反复训练5min。24h后再测试，记录进入暗室潜伏期和5min内的错误次数。

1.2.5 Y迷宫实验 Y迷宫有3个支臂和一个连接区，每臂均可通电源，不通电的支臂为安全区，其他两支臂则通电为非安全区，安全区与非安全区可随机改变。将小鼠放于起步区（未通电）适应3min，然后通电变换安全区；每当小鼠到达安全区30s后再随机改变安全区的位置，转变5s后非安全区底部通电，刺激小鼠足底而驱使其跑向安全臂。小鼠在10s内从非安全区一次性跑向安全区即被判为正确，否则均判为错误。以10次测试中正确的次数作为小鼠学习记忆的成绩。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析，实验数据以±s表示，样本均数比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠跳台学习记忆能力的影响 如表1所示，模型组的跳台学习成绩和记忆成绩较空白对照组明显下降，说明建成了记忆障碍模型。与模型组比较，阳性药组、迷迭香精油组、水溶性提取物组和脂溶性提取物组使小鼠跳台学习成绩和记忆成绩明显提高（P＜0.01）。

表1 迷迭香提取物对小鼠跳台成绩的影响（±s，n=10）

注：与空白对照组比，*P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比，**P＜0.01

组别 学习成绩（5min错误次数）记忆成绩潜伏期（s） 5min错误次数空白对照组 3.0±0.3 236.9±6.3 2.1±0.2模型组 4.6±0.4* 187.8±5.2* 3.0±0.4#阳性药组 2.9±0.3** 240.4±7.9** 1.9±0.2**迷迭香提取物精油组 3.1±0.2** 235.7±10.0** 1.7±0.2**水溶性组 2.7±0.3** 256.2±8.9** 1.2±0.2**脂溶性组 2.9±0.4** 253.9±7.6** 1.3±0.2**

2.2 对小鼠避暗学习记忆能力的影响 模型组的避暗实验潜伏期较空白对照组缩短，错误次数增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组、迷迭香精油组、水溶性提取物组和脂溶性提取物组的避暗潜伏期延长，错误次数减少，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表 2。

2.3 对小鼠Y迷宫学习记忆能力的影响 如表2所示，模型组的Y迷宫实验正确次数较空白对照组减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组、迷迭香精油组、水溶性提取物组和脂溶性提取物组Y迷宫10次实验的正确次数均有提高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 迷迭香提取物对小鼠避暗和Y迷宫成绩的影响（±s，n=10）

表2 迷迭香提取物对小鼠避暗和Y迷宫成绩的影响（±s，n=10）

注：与空白对照组比*P＜0.01；与模型组比，**P＜0.01

组别避暗实验 Y迷宫（10次实验的正确次数）潜伏期（s） 5min错误次数空白对照组 234.0±6.2 1.0±0.3 7.8±0.4模型组 183.4±5.3* 2.4±0.4* 4.2±0.4*阳性药组 213.4±8.0** 1.0±0.3** 6.8±0.4**迷迭香提取物精油组 206.8±2.0** 1.2±0.2** 7.0±0.5**水溶性组 221.4±2.7** 0.6±0.2** 7.4±0.8**脂溶性组 219.4±3.9** 0.8±0.2** 7.2±0.5**

3 讨论

学习记忆是中枢神经系统的高级思维活动，是由乙酰胆碱（Acetylcholine,Ach）、5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine,5-HT）、γ-氨 基 丁 酸（γ-ami nobutyric acid ,GABA）等多种神经递质参与的复杂的神经生理活动[3]。Ach作为中枢胆碱能神经末梢释放的重要化学递质，通过与胆碱受体结合，兴奋胆碱能系统，调节第一级记忆向第二级记忆的转移过程，是促进学习记忆的神经递质。东莨菪碱是M胆碱受体阻断药，通过阻断Ach与M受体的结合，影响乙酰胆碱介导的记忆功能。本实验用东莨菪碱建立记忆障碍模型，研究迷迭香提取物对小鼠学习记忆能力的影响，结果显示：东莨菪碱记忆障碍模型构建成功，迷迭香精油组、水溶性提取物组和脂溶性提取物组均可改善记忆障碍模型小鼠的学习、记忆能力。

Ach的生物合成以胆碱和乙酰辅酶A为原料，在胆碱乙酰化酶（Choline acetyltransferase, ChAT）的催化下合成。Ach在乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AchE）的作用下分解为胆碱和乙酸而失活。ChAT和AchE共同作用调节着Ach含量的动态平衡。东莨菪碱所致记忆障碍模型小鼠脑组织的Ach含量降低、AchE活性增高、ChAT活性降低，而降低AchE活性、增强ChAT活性、增加脑内Ach含量可提高小鼠的学习记忆能力[4，5]。Ach作为神经递质储存在胆碱能神经末梢突触的囊泡内，神经冲动产生时释放到突触间隙以发挥作用。但是，Ach的释放需要突触素（synaptophysin，SYP）及其他囊泡蛋白的调节。SYP是一种突触囊泡钙结合蛋白，通过与Ca2+结合、促使囊泡与突触前膜融合并开启融合孔，引起囊泡内Ca2+依赖性神经递质如Ach的释放[6]。研究显示，若突触素表达减少或缺失，Ach不能释放，导致突触信息传递障碍，引起记忆力下降[7]。因此，迷迭香提取物提高东莨菪碱所致记忆障碍模型小鼠的学习记忆能力的作用机制是增加Ach含量还是调节Ach的释放还有待进一步研究。

另外，迷迭香精油、水溶性提取物、脂溶性提取物均含有多种成分，其中迷迭香提取物油溶性有效成分主要为鼠尾草酸和水溶性有效成分主要为迷迭香酸。研究表明[8，9]，鼠尾草酸和迷迭香酸均有抗氧化作用，可抑制活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生，显著提高衰老小鼠机体抗氧化酶活性，降低机体的氧化负荷，减轻过氧化脂质的产生，有效延缓衰老。可见，迷迭香提取物对学习记忆能力的影响是某一活性成分的独立效应还是多种成分的联合效应，是单一作用机制还是多种作用机制，还有待实验研究论证。