融合表达白细胞介素10与卵清蛋白重组腺病毒口服变应原疫苗的构建及鉴定

马仕坤，关 剑，王 丹，甄宏楠，谢喜秀

变态反应性疾病如变应性鼻炎、变应性哮喘、食物过敏、药物过敏、特应性皮炎等是困扰人们生活和工作的常见健康问题，变应性休克更危及生命。2013年世界变态反应组织(World Allergy Organization，WAO)发布的白皮书显示，目前全球有2.0～2.5亿食物过敏患者、约3亿哮喘患者和4亿变应性鼻炎患者，药物过敏的患病率高达10%[1]。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)统计，每年全球约25万人死于哮喘，并且哮喘的发病率仍呈上升趋势，预计到2025年患病人数将达到4亿[2]。我国哮喘患病总人数预计3千万，其中儿童约1千万[3]。综合2010、2012及2013年全国卫生健康调查数据，有1.99%的受访应答者患有哮喘[4]。国际儿童哮喘及变态反应性疾病研究(International study of asthma and allergies in childhood，ISAAC)的数据显示，我国儿童哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎的患病率持续上升[5]。关于食物过敏患病率时间趋势的一项单中心研究显示，从1999年到2009年，0到24月龄儿童食物致敏率从9.9%上升到18%，食物过敏率从3.5%上升到7.7%，其中鸡蛋和牛奶过敏最为常见[6-7]。目前变态反应性疾病的治疗药物主要包括抗组织胺药、白三烯受体拮抗剂、糖皮质激素以及用于哮喘的支气管扩张剂等，但均为暂时性缓解症状。变应原特异的免疫治疗(allergen-specific immunotherapy，AIT)是唯一针对病因的长期有效的治疗手段。1911年Noon[8]首次发表利用花粉变应原提取液皮下注射进行免疫治疗的研究，迄今AIT已有100余年的历史，但AIT难以普及，其原因主要是接受AIT的患者需要在长达3～5年的时间内接受上百次的注射才能达到理想效果，且治疗过程中存在诱发严重全身不良反应的风险[9-10]。新的舌下含服的免疫疗法给药方便，但局部不良反应较多，相比皮下注射给药途径其疗程并未缩短[11-12]，并且也有发生严重不良反应的风险[13]。

基因治疗是一种新型高效的临床治疗策略，在肿瘤、遗传性疾病的治疗中已显示了明确的疗效及优势，在变态反应性疾病领域也有了一些尝试[14-15]。胃肠道黏膜相关淋巴组织是机体最大也是最复杂的免疫器官，进入肠道的抗原通过肠上皮细胞、M细胞、树突状细胞等摄取并处理，提呈给肠上皮淋巴细胞或肠道集合淋巴结中的淋巴细胞，进而发生相应的免疫反应。通常情况下，胃肠道黏膜相关淋巴组织对食物蛋白和共生菌等无害抗原表现为耐受，而对致病细菌、病毒等则发生免疫应答。胃肠道预先接触非致病性抗原后，再用同样的抗原通过肠外途径免疫动物不会引起明显的全身反应，此即诱导口服耐受[16]，还可以减轻远处其他组织的炎症性免疫反应，如皮肤的迟发超敏反应、速发变态反应和胰岛炎等[16-17]，也称为旁观者效应。白细胞介素(interleukin，IL)-10是口服耐受最重要的效应分子之一，具有强大的抗炎效应和诱导调节性T细胞生成的能力，在口服耐受诱导早期发挥关键作用，IL-10缺乏将导致建立耐受失败，而在口服抗原中加入微量的IL-10即可增强免疫耐受效果[18]。本研究拟构建一种可用于口服的、以不致病复制缺陷型腺病毒为载体的重组变应原基因疫苗，融合表达免疫调节因子IL-10及模式变应原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)，为后续验证该疫苗对变态反应性疾病的预防及治疗效应奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

目的基因小鼠IL-10和模式OVA的DNA序列(南京金斯瑞生物科技公司合成)；腺病毒穿梭质粒pHBAd-MCMV、腺病毒骨架质粒pHBAd-BHG及人胚肾细胞系HEK293 细胞(上海汉恒生物公司)；限制性内切酶、T4连接酶、DNA ladder(购自Fermentas公司)；质粒DNA大/小抽提试剂盒(康为世纪公司)；DMEM、胎牛血清、胰酶(美国Hyclone公司)；双抗(美国Invitrogen公司)；LipofiterTM 转染试剂[汉恒生物科技(上海)有限公司]；小鼠 Instant IL-10 ELISA试剂盒(美国eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 重组穿梭质粒构建：重叠PCR技术连接小鼠IL-10与OVA的DNA序列，设计引物序列如下：F：TCCAGACCCGGGACCGAATTCGCCACCATGCCT GGCTCAGCAC；R1：GCCCCCTCCGCCGCCTCCGC TTTTCATTTTGATCATCA；F2：GGAGGCGGCGGAG GGGGCGCCACCATGGGCTCCATCGGCGCAGCA；R：CGCTCGAGATCTGTAGAATTCAGGGGAAACACATCT GCCAAA。PCR产物克隆到穿梭质粒载体pHBAd-MCMV后转化感受态DH5α大肠杆菌，挑取阳性菌落，采用菌液PCR法筛选鉴定目的基因插入情况(图2)，将阳性克隆送上海铂尚生物技术有限公司测序进行鉴定，确定插入正确序列的重组穿梭质粒pAdIL-10-OVA。

1.2.2 重组腺病毒包装、扩增及滴度测定：取重组穿梭质粒pAdIL-10+OVA 2 μg及骨架质粒pHBAd-BHG 4 μg，脂质体共转染融合度70%～80%的293细胞。转染6 h后更换新鲜的细胞培养液，继续培养。每天观察细胞变化，待大部分细胞变大变圆且呈葡萄状并从培养瓶底部脱落时收获病毒。将培养瓶中所有细胞及培养液收于15 ml离心管中，用液氮及37 ℃水浴反复冻融3次。3 000 r/min离心5 min，收集含病毒上清液，此即重组腺病毒AdIL-10-OVA第一代毒种(P1)，弃沉淀。从P1代病毒上清(约3 ml)中取2 ml感染1个直径10 cm培养皿的细胞(保证含细胞90%以上)。病毒扩增2 d，待大部分细胞脱离培养瓶底面即可收获病毒，将细胞连同培养液一同收入15 ml离心管中，依据前面的冻融方法冻融3次，取上清进行下一代扩增，如此反复进行各代病毒扩增及收获。腺病毒滴度测定采用TCID50法。

1.2.3 重组腺病毒介导目的基因表达测定 将293细胞接种至24孔板，分别按50、100、200病毒感染复数(mutiplicity of infection，MOI)加入病毒液，次日取上清，遵循ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行IL-10检测。

2 结果

2.1 重组穿梭质粒构建结果

重叠PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。菌液PCR结果显示，所挑选阳性菌落含有目的插入片段(图2)，测序结果显示重组穿梭质粒多克隆区域插入目的基因序列正确，测序峰图(部分)见图3，完整测序结果分析见图1。

图 1 琼脂糖凝胶电泳分析重叠PCR产物Fig 1 Analysis of overlapping PCR products by agarose gel electrophoresis1：mIL-10+OVA PCR产物； 2：DNA Marker

图 2 琼脂糖凝胶电泳分析重组穿梭质粒菌液PCR产物Fig 2 Analysis of PCR products of recombinant shuttle plasmid liquid by agarose gel electrophoresis1～8：IL-10+OVA单克隆鉴定PCR产物(包含载体上的一段序列，故比理论大); 9： DNA Marker

2.2 重组腺病毒扩增后AdIL-10-OVA滴度测定结果

重组腺病毒扩增后滴度测定TCID50 法测得扩增后AdIL-10-OVA滴度为 T0= 101+(10.5-0.5)=1011.0TCID50/ml，将TCID50/ml换算成PFU/ml，则为T=1011.0-0.7=1010.3=2×1010PFU/ml。

2.3 重组腺病毒介导融合目的基因表达

随着MOI的增加，重组腺病毒感染293细胞上清中IL-10表达水平亦升高；融合表达载体的IL-10表达效率低于单独表达IL-10载体，增大MOI可提高融合蛋白表达水平(图4)。

3 讨论

腺病毒是目前常用的基因治疗的载体(Journal of Genetic Medicine website:www.wiley.com.uk/genmed/clinical)，具有以下优势：(1)基因转移效率高，宿主细胞类型广泛，既可以感染分裂期细胞，A：目的基因小鼠IL-10 ATG开始部分测序峰图; B：目的基因融合部分序列; C：目的基因OVA ATG开始部分测序峰图亦可以感染非分裂期细胞;(2)产生病毒滴度高，可达1011PFU/ml，易于制备和操作;(3)外源基因容量大，可插入7～8 kb的片段;(4)外源基因独立于靶细胞染色体外表达，不会引起宿主细胞基因组的重组和突变。在用于遗传性疾病或肿瘤基因治疗时，腺病毒最大的劣势在于其载体免疫原性和目标基因的表达时限，而当其用于免疫性疾病如变态反应性疾病的治疗时，却不存在这样的问题。因为短期甚至是单次的给药足以引起有效的免疫效应[19-25]，并且针对腺病毒的免疫反应本身对纠正变态反应性Th2相反应有利，抗原激发前感染腺病毒能够使针对抗原的Th2 相反应转向Th1相，从而抑制抗原特异性的变态反应[26-27]，尤其值得注意的是，腺病毒可在呼吸道和肠道黏膜存活，具有黏膜活疫苗的应用前景[28]。近期Park等[29]及Oomura等[30]分别用模式变应原OVA和蟑螂变应原建立哮喘模型，发现腺病毒介导的FOXP3基因可在呼吸道上皮细胞表达，非特异性的抑制不同变应原所诱导的气道炎症。口服是更为简便而常用的给药方式，并且口服腺病毒载体疫苗的效应不受先前存在的针对疫苗载体的免疫反应的影响。提示口服腺病毒载体方法可以重复使用，腺病毒载体是极有前景的免疫治疗基因载体。

图3重组穿梭质粒pAdIL-10+6Gly+OVA目的基因测序结果

Fig3Sequencing results of recombinant shuttle plasmid PAdiL-10+6Gly+OVA

图 4 不同感染复数重组腺病毒感染细胞上清IL-10水平Fig 4 IL-10 level in cell supernatant infected by different multiple of recombinant adenoviral

随着DNA合成技术的快速发展，DNA合成长度及精度不断提高，在遗传学、分子生物学等领域得到广泛应用[31-32]。本研究摈弃传统的克隆策略，通过DNA合成技术直接合成目的基因IL-10和OVA，显著提高了效率，测序结果显示，合成的基因IL-10和OVA序列与目标序列完全一致，然后通过重叠延伸PCR技术直接连接。重叠PCR是一种新型PCR技术，最早由Ho等[33]和Horton等[34]用于定向诱变和融合基因构建，目前该技术在DNA重组构建、基因定点改造、长片段基因合成、基因敲除、基因体外分子进化等方面得到了广泛应用。

细胞因子IL-10由活化的白细胞产生，具有以下强大的免疫调节功能：(1)可抑制炎性介质及炎性趋化因子的分泌；(2)增强抗炎介质如IL-1受体拮抗剂和可溶性肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)受体的释放；(3)下调主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex type Ⅱ，MHCⅡ)分子及共刺激分子如CD86(B7)的组成性及INF-γ诱导的表达，从而抑制单核巨噬细胞的抗原提呈功能；(4)抑制IL-12合成，影响Th1免疫；(5)促进B细胞增殖分化，阻止B细胞凋亡，阻止免疫球蛋白IgG4向IgE转换；(6)降低IgE受体及其信号分子Syk、Fyn及Akt的表达，减轻IgE介导的变态反应；(7)诱导T0细胞向Tr1细胞分化，并作为旁分泌因子作用于Treg细胞以维持FOXP3表达[35-36]。FOXP3是CD4+CD25+Treg细胞发育和功能的关键基因[37]，同时还是IL-2转录的负调节因子，其表达限制T细胞的活化和增生。IL-10在口服耐受建立早期发挥关键作用，Slavin等[38]研究发现，IL-10和髓鞘基质蛋白同时口服可以明显减低实验性自身免疫性脑脊髓炎的严重程度和发生率，联合口服IL-10和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白亦可以显著减少髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎的复发。

Sudowe 等[39]以腺病毒为载体构建了表达变应原的重组腺病毒疫苗，发现在致敏前给予单次剂量的重组腺病毒变应原疫苗即可有效抑制变应原特异IgE的产生，免疫反应倾向Th1相。Yamasaki 等[40]研究也发现表达OVA的重组腺病毒疫苗单次十二指肠给药能有效预防OVA口服引发的小鼠腹泻及严重变态反应。现有的研究在重组腺病毒变应原疫苗对变态反应的预防效应方面取得了一致的结果，但其治疗效应有待进一步研究。Maecker等[41-42]构建了多种细胞因子与模式变应原OVA的融合表达质粒，发现融合表达的细胞因子生物活性不受影响，可以改变针对OVA的变态反应，融合表达载体的预防及治疗效应优于二者的单独联合。本研究成功构建了融合表达IL-10与变应原的重组腺病毒口服疫苗，为后续变态反应性疾病的预防和治疗策略提供了有用的研究工具。

志谢:感谢北京协和医院中心实验室分子生物学平台龙波博士、陈翠珠硕士在实验过程中给予的无私帮助