非酒精性脂肪性肝病中肝细胞脂肪变性分子机制的研究

韩伟佳， 刘 霜， 段钟平， 吴 桥

首都医科大学附属北京佑安医院疑难肝病与人工肝中心 北京市肝衰竭与人工肝治疗研究重点实验室，北京 100069

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，而以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的遗传-环境-代谢应激相关性临床病理综合征[1]。目前，NAFLD在美国的患病率为10%～40%，在亚太地区的患病率为7%～40%，已成为慢性肝脏疾病的主要原因，有逐渐超过酒精性肝病和病毒性肝炎发病率的趋势[2]。有研究[3-5]总结，我国NAFLD的发病率逐年上升，平均发病率约为20.9%，华东地区的发病率甚至高达38.17%。

NAFLD进展较为缓慢，一般情况下，NAFLD无临床症状，多是在健康体检或检查其他疾病时发现肝功能异常或脂肪肝。但随着病情进展，会出现单纯性脂肪肝(肝脂肪堆积)、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和可能的肝细胞癌等一系列疾病[6-8]。组织活检是NAFLD诊断的金标准，组织形态主要表现为巨细胞增生，然而，肝活检存在着微观不均匀性、核心长度的山姆抽样误差等问题，此外，组织活检为侵入性手术，可能导致危害生命的并发症[9-12]。因此，了解NAFLD的发病机制，不仅有助于治疗，也可为简单、无创、可靠地预判NAFLD的诊断方法的研发提供新的思路。

NAFLD的主要致病机制之一是脂代谢紊乱，导致脂质沉积，即肝脏获取的游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)超过肝脏自身处理能力(β氧化能力)，甘油三酯淤积所造成的。脂质淤积在分子生物学领域表现为FFA摄取合成增多、脂质氧化分解减少、脂蛋白输出相对不足等[13-16]。NAFLD的标志性改变是肝细胞的细胞质中甘油三酯的聚积，这是由于脂质获得(即脂肪酸摄取和从头脂质生成)和去除(即线粒体脂肪酸氧化和作为极低密度脂蛋白颗粒的组分输出)之间的不平衡引起的。在这里，我们回顾了肝脏对脂肪酸和甘油三酯的生理加工及导致NAFLD的病理生理变化的分子机制(见图1)。游离脂肪酸摄取：脂肪酸转运蛋白(FATP)2、FATP5和CD36介导游离脂肪酸跨质膜的转运。一旦被摄入胞质溶胶中，脂肪酸被FATP或脂酰CoA合成酶(ACS)的活性激活形成酰基-CoA。脂质从头合成：棕榈酸是由葡萄糖新合成的。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合酶(FAS)分别催化速率限制和最终步骤。在ACS介导的活化后，棕榈酰辅酶A被长链脂肪酸延长酶6(ELOVL6)延长且被硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)去饱和。酰基-CoA被甘油-3-磷酸(G-3-P)酰基转移酶(GPAT)酯化形成溶血磷脂酸(LPA)和1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶(AGPAT)以形成磷脂酸(PA)。PA通过脂质去磷酸化以形成二酰基甘油(DAG)，其通过酰基-CoA，二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)酯化成另一酰基-CoA分子以形成甘油三酯(TG)。脂肪酸氧化：酰基辅酶A通过外部转运到线粒体中，线粒体外膜和线粒体内膜由肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT)1、CPT2和肉碱酰基肉碱转位酶(CACT)的活性组成。在线粒体内，酰基-CoA被氧化形成乙酰-CoA。极低密度脂蛋白(VLDL)合成：通过微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)的活性将甘油三酯与ApoB-100一起包装到内质网(ER)中的VLDL中并分泌到窦周间隙中。红色箭头表示NAFLD中出现的增加和减少。在NAFLD患者体内，FFA摄取和脂质从头合成两种途径致使脂肪酸合成增多，但是脂肪酸的氧化速率或VLDL生产率不能随之增快，故而会致使NAFLD的发生。

图1 肝细胞脂质代谢的机制及其在NAFLD中的失调机制Fig 1 The mechanism of hepatocyte lipid metabolism and disorder mechanism in NAFLD

1 FFA的摄取

1.1CD36CD36是细胞表面的一种清道夫受体，存在于细胞膜的脂筏结构上，对脂质的转运内吞和信号传导非常重要。CD36是单核巨噬细胞吞噬氧化型低密度脂蛋白的主要受体，可与FFA结合，促进摄取[17-18]。研究[19-20]普遍认为，患者血清CD36水平升高是脂肪变性的前兆，这种现象随着年龄增长愈发明显。NATH等[21]发现，上调HepG2细胞的CD36表达水平后，HepG2细胞的上皮细胞间质转化现象明显增强，进一步探索发现，这是由于FFA摄取增多，TGF-β信号通路表达上调造成的。故CD36水平的升高也会加速肝癌的进程。CD36是芳香烃受体(AhR)的靶基因，且其相应的活化是肝脏中甘油三酯沉积所需的，此外，孕烷X受体(PXR)诱导肝脏CD36 mRNA表达，同时肝脏中脂肪酸摄取和甘油三酯积累增加，最后，CD36是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的转录靶点，其被PXR上调[22-23]。

1.2脂肪酸转运蛋白(fattyacidtransportproteins，FATPs) FATPs是膜结合蛋白，在FFA的摄取中发挥重要的作用[24]。有研究[25]发现，小鼠中敲除FATPs基因后，脂肪细胞中的甘油三酯含量显著下降。血清FATPs的水平与NAFLD的发病密切相关，BECHMANN等[26]发现，在NAFLD患者体内，FATPs升高水平与FFA的升高水平高度一致，FATPs可为预测NASH的发病机制提供一种新的方法。

2 肝细胞内脂肪酸的转运体

脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein，FABP)是广泛存在于人体细胞质中对脂肪酸有高亲和力的可溶性蛋白质，主要功能是与脂肪酸特异性结合，并将脂肪酸从细胞膜运送到甘油三酯和磷脂合成或分解的位点，广泛参与脂肪酸的吸收、转运和代谢[27-29]。肝型FABP(LFABP)是FABP家族中首先被发现的，LFABP主要通过扩散机制将FFA吸收转运入细胞[30-31]。血清LFABP的含量同样可以作为判断NAFLD进展的指标，LFABP表达的降低能够减少肝细胞的氧化反应和对FFA的摄取，从而减轻肥胖的发生[32-33]。ZENIRLER等[34]发现，NAFLD的患者体内LFABP明显高于正常人。HOO等[35]发现，LFABP抑表达的小鼠同时进行高脂喂养后，实验组的小鼠更不易发生肥胖、脂肪变性。

3 肝内脂质从头合成的途径

3.1合成途径中各种限速酶正常情况下，由乙酰辅酶A(CoA)从头合成产生的甘油三酯仅为总合成甘油三酯的5%，在病理状态下，肝细胞脂质从头合成产生的甘油三酯可以达到1/3[36]。在这一过程中，限速酶起到了重要的作用。乙酰CoA系统对于从头合成至关重要，主要包括：乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)和乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase，ACS)。其中，ACC是从头合成的限速酶。

ACC以生物素为辅酶催化底物乙酰化、脱乙酰及乙酰基转移的大家族。在FFA合成过程中，ACC羧化乙酰-CoA形成丙二酰-CoA，是FFA从头合成的关键步骤，是此过程中高度调控的酶[37-38]。抑制ACC的表达能够减轻NAFLD的进展。ABU-ELHEIGA等[39]发现，在敲除ACC基因后对小鼠进行高脂喂养，与对照组相比，实验组具有较低的体质量、较低的非酯化脂肪酸和甘油三酯水平，这种现象是通过降低AKT通路水平达成的。除AKT通路，腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)同样会使ACC磷酸化失活[38]。ACS激活FFA形成脂肪酸辅酶A，是FFA进入生物活性池的必经之路[40]。

3)对于过流保护而言，当重合闸整定时间由2 s增加至2.5 s时，允许滑落性故障的延时将从2.83 s增加至3.33 s。对于速断保护而言，忽略保护动作时间，当重合闸整定时间由2 s增加至2.5 s时，允许滑落性故障的延时也将从2.33 s增加至2.83 s。此时对于滑落性延时故障来说，重合成功的可能性就非常大。

3.2重要的与脂质合成相关的转录因子

3.2.1 胆固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)：SREBP-1c是真核细胞内调控脂代谢的关键核转录因子家族，主要通过调控脂类合成相关酶基因的表达，调节脂类合成和体内能量稳态[41]。SREBP-1c参与NAFLD的进程，是脂质合成代谢的重要调控因子。有研究[42]发现，SREBP-1c在NAFLD患者体内有明显高表达。内质网应激在NAFLD发生、发展过程中起重要的作用，究其原因，是内质网应激所引起SREBP-1c表达上调造成的，抑制SREBP-1c表达后，FFA合成明显减少[43]。RHEE等[44]发现，应用生胃酮这种具有抑制SREBP-1c功能的药物后，NAFLD小鼠模型的FAA和甘油三酯合成明显减少，进一步的体外实验发现，生胃酮可抑制FFA诱导的HepG2细胞活性氧生成及逆转FFA诱导的线粒体膜去极化。

3.2.2 过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferater-activated receptor γ，PPARγ)：PPARγ是一类配体激活的核转录因子超家族成员，是一类由配体激活的核转录因子，活化后可以调控多种核内靶基因的表达，具有多种生物学效应。在FFA合成中同样具有重要的调控作用，PPARγ可以通过活化脂肪细胞中CoA促进脂肪细胞中FFA合成增加，继而导致甘油三酯合成增加，导致脂肪细胞体积增大[45-46]。有研究[47]发现，NAFLD的发生与PPARγ基因的变异有明确的关联(OR=2.23，95%CI：1.30～3.81)。有研究[48]进一步发现，PPARγ基因中的脯氨酸的多态性是NAFLD的遗传易感性的重要原因。

4 脂肪酸在线粒体内β氧化的途径

4.1线粒体内β氧化的过程FFA可通过多种途径被氧化，比如线粒体α-氧化、β-氧化和ω-氧化。其中，线粒体β氧化应激是最主要的途径[49-50]。与线粒体β氧化相关的基因通常有PPARα调节，如非常长链酰基-CoA脱氢酶(very long chain acyl-CoA dehydrogenase，VLCAD)、长链酰基-CoA脱氢酶(long chain acyl-CoA dehydrogenase，LCAD)和长链酰基-CoA合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase，ACSL)。尽管PPARα活性与肝脏脂代谢有关，但PPARα表达水平与肝脂肪变性之间的相关性不一致[51-52]。

经典β氧化包括4个连续的反应。(1)氧化反应：CoA脱氢生成2-反-烯脂酰CoA；(2)水化反应：2-反-烯Co-A加水转变为3-羟脂酰CoA；(3)脱氢反应：3-羟脂酰CoA脱氢生成3-酮脂酰CoA；(4)硫解反应：3-酮脂酰CoA硫解产生1分子乙酰CoA(或丙酰CoA)和碳链缩短了的脂酰CoA，随后进入下一个循环。这一反应所需的CoA来源于FFA，FFA在首先活化成为脂酰CoA，之后在限速酶的辅助下进入线粒体，释放出CoA，用于β氧化[53]。过氧化物酶脂肪酸氧化损伤导致肝脏内二羧酸的积累，这种二羧酸的积累可导致线粒体损伤和微囊脂肪变性，与NAFLD的发展风险增加有关。有研究[49，54]表明，增加肝脏脂肪酸摄取或生物合成而增强PPARα的激活，肝脂肪变性、代谢综合征和NAFLD患者肝脏的氧化率增加。

4.2各种限速酶的表达情况及作用

4.2.1 肉毒碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmitoyltransferase，CPT)：CPT分为CPT1和CPT2两类。CPT1是FFA的β氧化过程中重要的限速酶，位于线粒体外膜，催化FFA从酰基CoA转移到肉毒碱上，进而从胞浆进入线粒体内部，并且进一步在同样位于线粒体内膜上的CPT2催化下进行β氧化。此外，CPT1能够间接决定细胞质中脂酰CoA的含量[55-56]。XIAO等[57]对NAFLD模型实验组小鼠转染肝细胞刺激因子后，小鼠CPT1表达明显升高，FAA淤积明显减少，转氨酶降低，进一步体外实验发现，对油酸处理的HepG2细胞进行CPT1基因抑表达处理后，将肝细胞刺激因子转染，HepG2细胞CPT1表达升高，细胞内的脂质沉积减少。同样有研究[58]发现，氧化CPT1会阻碍β氧化进程。

4.2.2 肉毒碱脂酰转移酶(carnitine acyl-transferase，CACT)：CPT1将FFA转化为脂酰肉毒碱后，CPT2催化成为脂酰CoA前，需经CACT辅助移入线粒体基质[59]，CACT对CPT1和CPT2功能的发挥起到重要的桥梁作用。

5 甘油三酯从肝细胞内分泌入血途径

5.1甘油三酯在肝细胞内的组装过程甘油三酯的合成主要有甘油-酯途径和磷脂酸两种途径。在肝脏中，以磷脂酸途径为主(见图1)。游离的甘油经甘油激酶催化，生成α磷酸甘油。α磷酸甘油在脂酰转移酶作用下，与两分子脂酰CoA反应生成3磷酸-1，2甘油二酯即磷脂酸。磷脂酸在磷脂酸磷酸酶作用下，水解释放出无机磷酸，而转变为甘油二酯，它是甘油三酯的前身物，只需酯化即可生成甘油三酯。微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)促进ApoB-100的酯化，MTP是一种内质网驻留蛋白，具有ApoB-100结合和脂质转移结构域，新生VLDL颗粒，包装成VLDL运输囊泡，从内质网运输到高尔基体。在这些过程中，成熟的VLDL颗粒通过MTP的活性进一步酯化，随后VLDL颗粒被排出细胞外至肝窦周隙[60-61]。

5.2ApoB转运体的作用ApoB-100在VLDL的合成中起到了重要的作用，ApoB-100内富含两性α螺旋的结构域和多处β片层分子，β片层分子既疏水区又包含亲水区，疏水区主要负责VLDL的转运[62-63]。ApoB-100是一种长多肽，其在内质网腔内被甘油三酯脂化，同时它被翻译并易位穿过内质网膜。有研究[64]发现，肥胖与ApoB-100的缺陷密切相关，VLDL转运障碍直接导致脂质沉积，甚至肝纤维化。此外，NAFLD中ApoB-100的分泌未增加，表明ApoB-100的产量限制了肝脏输出肝脏甘油三酯的能力[65]。

VLDL是甘油三酯运输出肝脏的主要形式，甘油三酯的来源主要包括两种形式：(1)肝细胞摄取的FFA所得；(2)脂酰CoA经β氧化所得。在这一过程中，FFA摄取过度、从头合成异常、β氧化障碍、VLDL排出障碍都是导致脂质代谢紊乱，继而出现NAFLD。肝脏是FFA和甘油三酯合成代谢的主要器官，在营养过剩的情况下代谢途径的活性改变导致称为NAFLD的常见慢性肝病。考虑到这种生物医学相关性，关于肝脏脂质代谢基本方面的许多重要问题仍无答案。这些包括：(1)在过度营养的情况下，哪些脂肪酸转运蛋白导致细胞内脂肪酸浓度增加？(2)肥胖和NAFLD患者从头脂质合成增加的确切机制是什么？(3)在代谢途径中FFA和酰基辅酶A的确切分子机制是什么？(4)在营养过剩的情况下如何调节FFA氧化率？总之，需要更深入地了解FFA摄取和合成与肝脏内氧化和分泌之间平衡的精确机制。这将有助于更好地了解甘油三酯如何积累并应用到管理NAFLD的新治疗策略中。