HBV RT区耐药变异对HBsAg的影响

庞亚博， 汪莉萍

徐州医科大学附属医院感染病&肝病科，江苏 徐州 221003

物竞天择，适者生存。达尔文的进化论适用于所有生物，包括乙肝病毒。当生物遇到“生存阻力”时，往往会通过变异来适应新的环境，这种变异通常是有利于生物生存的。就乙肝病毒而言，“生存阻力”可见于人体免疫的攻击、抗病毒治疗等[1]。乙肝病毒通过产生变异株从而逃避来自各个方面的威胁，得以继续繁衍生存。HBV变异可见于各个基因区[2]：P基因、S基因、C基因、X基因，与核苷类似物耐药密切相关的变异位于HBV P基因的RT区，变异可为点突变、插入突变、缺失突变等，点突变包括同义突变、无义突变、错义突变。由于S区(nt155-835)完全重叠于RT区(131～1161)(见图1)，故当RT区某些碱基发生改变时，不可避免地会导致S区相应位点发生改变，从而使S区编码的HBsAg发生变化[3]。核苷类似物诱导RT区变异后，耐药株相比野生株所表达的HBsAg有何改变，目前仍是国内外学者研究的热点，现就该研究方向作一概述。

图1 耐药相关的HBsAg变异位点 Fig 1 The HBsAg mutation sites associated with drug resistance

1 HBV RT区耐药的本质及常见的耐药位点

1.1RT聚合酶的结构和功能P基因是HBV DNA序列中最长的ORF，它含有约2 496个核苷酸(不同基因型有所差异)，编码P蛋白[4]，P蛋白是一种多功能蛋白，由816个氨基酸构成，整体分为4个部分(见图1)，起始部即氨基端为末端蛋白，接着是一段空白区，然后是RT聚合酶区，最后是羧基末端RNA酶H。末端蛋白的功能是协助RT聚合酶与模板pgRNA结合，标志着逆转录的开始；空白区由于相关研究较少，目前其功能尚未完全明确；RT聚合酶的主要功能是在逆转录过程中将pgRNA转化为双链HBV DNA；RNA酶H的功能是水解pgRNA。与耐药密切相关的酶是RT聚合酶，它具有两种酶的活性[5]，即依赖RNA的DNA聚合酶活性和依赖DNA的DNA聚合酶活性，在HBV逆转录过程中，RT聚合酶先以3.5 kb的pgRNA为模板，催化肝细胞内的原料核苷酸聚合成DNA的正链，当pgRNA被RNA酶水解之后，RT聚合酶再以新合成的DNA正链为模板，同样以肝细胞提供的核苷酸为原料，合成负链DNA，随后正负链DNA形成环状结构，并与新合成的病毒蛋白装配成子代病毒，释放到血液中。

1.2核苷类似物耐药的本质是RT聚合酶发生了突变“耐药”是指病原体对药物产生了耐受，针对该病原体的药物不再敏感或有效。核苷类似物的作用靶点是RT聚合酶区[6]，HBV逆转录过程需要原料核苷酸结合到RT聚合酶上，由于核苷(酸)类似物与人体正常的核苷酸结构相似，且其与RT聚合酶的亲和力较高，所以它们可以“以假乱真”，替代正常的核苷酸渗入到延长中的DNA链，但由于它们缺少正常核苷酸的3′-OH，不能形成正常的3′，5′磷酸二酯键，且RT聚合酶无3′，5′核酸外切酶的活性，无法切除错配的核苷酸，导致HBV链复制终止，从而起到抗病毒的作用。核苷类似物诱导乙肝病毒发生耐药的本质[7]，是突变的RT基因编码出突变的聚合酶，改变了空间构象的RT聚合酶与核苷类似物亲和力降低，恢复了与正常核苷酸的结合，从而使病毒的DNA链得以继续延长复制下去。

1.3常见的核苷类似物的耐药位点由344个氨基酸构成的RT聚合酶，包括A～F 6个区(见图1)，分别为F domain(37～47)；A domain(75～91)；B domain(163～189)；C domain(200～210)；D domain(230～241)；E domain(247～257)。核苷类似物的耐药位点可分布于A～E各个不同区域。各核苷类药物常见耐药位点如下[8]：拉米夫定(LAM)主要耐药位点位于C domain，YMDD变异最常见；替比夫定(LDT)主要耐药位点位于C domain(rtM204V)；阿德福韦酯(ADV)主要耐药位点位于B domain(rtA181V/T)和D domain(rtN236T)；恩替卡韦(ETV)主要耐药位点位于C domainrt(M204V/I±L180M)、B domain(rtI169T or rtS184G)、C domain(rtS202G/I)、E domain(rtM250V)。

2 耐药相关的HBsAg变异特点

2.1耐药相关的HBsAg的改变通常位于“a”抗原决定簇之外HBsAg是S基因(nt155-833)以ATG为起始密码子编码的，由226个氨基酸构成的蛋白质，其中，第124～147位之间的24个氨基酸通过二硫键形成双环结构，被称为“a”抗原决定簇[9]，它是主要的亲水区，HBsAb即是通过Fab段与该亲水区共价结合。大部分耐药相关的HBsAg变异位于HBsAg的“a”抗原决定簇之外[10]，即第124～147位以外的氨基酸。例如，rtV173L、rtM204V、rtM204I分别引起HBsAg第164位、195位、196位氨基酸改变：sE164D、sI195M、sW196L/S/*[11]。只有少数耐药相关的突变发生在HBsAg抗原决定簇之中[12]，例如部分LAM耐药株(rtV173L+rtL180M+rtM204V)的“a”抗原决定簇有重要而显著的改变(sE164D+sI195M)[13]，突变后的HBsAg与S抗体(疫苗相关性)的结合能力明显下降，从而发生免疫逃逸，这在临床工作中有很重要的意义。

2.2RT区变异可导致HBsAg截短或分泌障碍前文已述及，S区(nt155-835)完全重叠于RT区(131～1161)，两者在同一方向上通过移码的方式各自翻译，RT区某些碱基发生改变时，不可避免地导致S区相应位点发生改变，从而使其编码的HBsAg发生变化。例如，LAM相关的耐药突变，RT区可发生rtM204I变异，导致对应位点的S区由TGG→TAG，TAG为终止密码子(见图2)，不再编码蛋白质，致使S抗原出现sW196*的改变[14]，即HBsAg第196位以后的氨基酸缺失，从而引起HBsAg的截短。这种截短了的病毒蛋白通常有分泌障碍，被阻滞在肝细胞内，无法分泌到血液中，血清HBsAg含量随之降低。类似的还有RT区的181位点[15]，rtA181T→sW172*，表面抗原的172位之后氨基酸缺失[16]，HBsAg的羧基端较前截短了约50个氨基酸[17]，同样会导致HBsAg含量下降。另外，RtA181T变异除了可导致S抗原出现sW172*的改变之外，也可导致S抗原出现sW172L的变化，此变异株产生的病毒蛋白也有分泌障碍，血清中测得的HBsAg也会降低，但比起sW172*的变异株，仍逊一筹，ZHOU等[18]专门研究并比较了此二者的差异。

2.3部分RT区变异未导致HBsAg发生结构和功能的改变然而，并非所有的RT区变异均会导致HBsAg发生结构和功能的变化，原因如下：S基因转录并翻译形成HBsAg的过程，同大多数基因编码蛋白质的过程一样，先由基因转录为mRNA，然后以mRNA为模板，每相邻的3个碱基构成一个密码子，每个密码子(mRNA)都与携带着特定氨基酸的反密码子(tRNA)互补配对，最后所有的氨基酸通过酰胺键顺序相连构成蛋白质。由于密码子与氨基酸是“多对一”的关系，若碱基突变后产生的新密码子仍然编码该氨基酸时(即同义突变)，氨基酸就不会发生变化，构成的蛋白质也不会发生变化，例如，rtL180M、rtT184G、rtS202G等位点变异不会导致HBsAg发生改变[19]。

图2 rtM204I突变模式可导致HBsAg第196位及以后Aa缺失sW196* Fig 2 rtM204I mutation can cause Aa loss on and after 196 site of HBsAg protein

2.4常见的RT区变异位点与突变位点的对应关系

近年来，不断有新的影响HBsAg表达的P区耐药位点被发现[20-21]。目前国内外研究者已发现的两者之间的对应关系如表1所示：

表1 核苷类似物的耐药位点与HBsAg突变位点的对应关系 Tab 1 The relationship between NAs resistance related mutation and HBsAg mutation

注：LAM：拉米夫定；LDT：替比夫定；ADV：阿德福韦酯；ETV：恩替卡韦。A：腺嘌呤/丙氨酸；D：天冬氨酸；E：谷氨酸；F：苯丙氨酸；G：鸟嘌呤/甘氨酸；I：异亮氨酸；L：亮氨酸；M：甲硫氨酸；N：天冬酰胺；S：丝氨酸；T：苏氨酸；V：缬氨酸；W：色氨酸。

3 耐药相关的HBsAg的改变具有重要临床意义

LEE等[22]首次证实了rtV191I相关的HBsAg突变sW182*，可导致肝癌的发生；SALPINI等[23]进一步研究发现，突变之后产生有缺陷的HBsAg，在肝细胞内大量堆积，激活了肝细胞内与氧化相关的信号通路，造成细胞毒性作用，从而导致肝细胞发生癌变。目前，有关HBsAg新的研究越来越受到人们的重视。既往认为，在患者口服核苷类似物过程中，通过血清HBV DNA上升、肝功能波动可初步预测是否发生耐药，与此同时，若观察到表面抗原有显著的改变，也可从侧面辅助性地推测是否发生耐药。有关耐药相关的HBsAg突变，需要我们进一步更深入地研究。