荧光染色法与KOH湿片法的回顾性研究

李翔英 廉翠红

(深圳大学第一附属医院 (深圳市第二人民医院)皮肤科，深圳 518035)

浅部真菌病是皮肤病中的常见病和多发病，建立一种快速而准确的检验方法尤为重要。常用的真菌检验方法有直接镜检、真菌培养、组织病理等。由于直接镜检方法简便，可快速得出检验结果，是临床最常用的检验方法之一。真菌直接镜检有多种浮载液可供选择，其中KOH使用最为广泛，其缺点是角质溶解慢，一般需要加热，加热不当易致气泡产生，且成片背景杂乱，真菌结构不易分辨和判断，易出现假阴性或漏诊；荧光染色法是一种利用重组几丁质酶来检测标本中是否存在真菌有形成分的方法。真菌荧光染色液中，经过特殊荧光素标联的重组几丁质酶可以高亲和力与真菌细胞壁上的几丁质结合并发出荧光，在荧光显微镜下可以清楚的观察到真菌形态。浮载液体用荧光染色液替代KOH溶液，镜下菌丝形态结构清楚易辨，背景干净、清晰，反差大，孢子染色后结构清晰，易于分辨，大大提高真菌阳性率，且显著缩短真菌镜检时间。

1 对象与方法

1.1 病例选择

选取2017年6月1日～8月31日于我科进行真菌直接镜检的患者，共获得病例716例，其中荧光染色法548例，KOH湿片法168例，取材来源包括疑似体癣、股癣、花斑糠疹、手足癣等患者的皮损。

1.2 材料

10%KOH溶液 (实验室自配)；真菌荧光染色液 (莱芙特敏真菌荧光染色液)。

1.3 操作步骤

①取材：75%酒精消毒患处后，用钝刀刮取患处或用透明胶带粘取患处皮屑；皮屑取皮损的活动性边缘；水疱取疱壁和基底部皮损；脓疱取脓液，间擦性皮损去除浸渍表皮，刮取基底部损害；采集甲标本时刮取靠近病甲甲床的碎屑。②KOH湿片法：将皮屑置于玻片中央，滴1滴KOH后盖上盖玻片，并过火焰2～3次轻微加温，轻压盖玻片吸出多余液体后，置于显微镜下观察，先用低倍镜查找菌体，然后换高倍镜观察菌体结构，以查到菌丝或孢子为阳性结果。③荧光染色法：将皮屑置于玻片中央，滴1滴荧光染色液后盖上盖玻片，轻压盖玻片吸出多余染色液后，置于荧光显微镜下查找真菌菌丝或孢子。

1.4 统计学方法

采用SAS 9.1统计学软件对检查结果进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本次实验共纳入病例716例，包括男性患者379例，女性患者343例，男女比例约为1.12∶1，包括手足癣、体股癣、花斑糠疹、甲癣等。荧光染色法共548例，阳性患者309例，阳性率为56.4%；KOH湿片法共168例，阳性患者50例，阳性率为29.8%。用SAS 9.1统计学软件对两组数据进行卡方检验，P<0.01，说明荧光染色组和KOH湿片法组差异有统计学意义，荧光染色法组阳性率明显高于KOH湿片法组。

从表1可知，体股癣组、花斑糠疹组荧光染色法阳性率明显高于KOH湿片法 (P<0.01)。但在手足癣组、甲癣组，虽然实验组阳性率高于对照组，但经过统计学检验P>0.01，显示两组数据的差异无统计学意义，考虑原因为：①手足癣足及甲癣组样本量较少，尤其是对照组样本量少；实验组与对照组样本数量差异较大；②检验人员的经验不足及操作不当；③临床医生诊断经验不足。后续改进措施：①扩大样本量；②设计严格的对照实验，如自身对照，确定合理的实验组及对照组样本量；③对检验人员进行培训及定期考核，规范操作流程。

表1荧光染色法与KOH湿片法阳性率的比较

Tab.1The comparison of positive rate in Fluorescent Staining and KOH Wet Method

荧光染色法KOH湿片法例数阳性阳性率例数阳性阳性率P值手足癣1012625.7%49816.3%0.196体股癣23715766.2%782532.1%0.0001花斑糠疹1228872.1%351645.7%0.0036甲癣883843.2%6116.7%0.395合计54830956.4%1685029.8%<0.01

3 讨 论

本次研究中，图1为1例股癣患者KOH湿片法的10×40倍镜下观，可以看到交织呈网状的细长菌丝和散在孢子，但背景杂乱，菌体结构显示不清，严重影响结果判读。图2～4分别为股癣、甲癣、花斑糠疹患者荧光染色法的镜下观，在荧光下，可以看到真菌菌丝及孢子含有几丁质的细胞壁呈现荧光蓝色，与背景对比明显，可见菌丝横隔，更易快速、准确地对检测结果进行判读，大幅提高检验的阳性率及检验效率。

浅部真菌病，尤其是皮肤癣菌病是皮肤科的常见病、多发病，真菌直接镜检是一种简单、经济、高效的真菌检验方法，能有效提高真菌病的诊断率，减少误诊。为了更快、更准确的为临床提供诊断依据，真菌直接镜检的浮载液经过不断的改良[1-8]，目前最常用于临床的是KOH溶液、KOH可以软化和溶解角蛋白、脂肪等组织碎屑，使真菌形态更清晰，但背景杂乱等问题一直无法得到较好的解决，导致KOH湿片法直接镜检有较高的阴性率和假阳性率，且严重依赖于检验人员的技术水平。荧光染色液中荧光标记的重组几丁质酶可以特异性的与真菌细胞壁上的几丁质结合，而角蛋白、脂质等成分不着色，使真菌菌丝和孢子与背景对比明显，解决了KOH湿片法中背景杂乱的问题，大幅提高真菌镜检的阳性率，且不需要加热加速角质溶解，具有操作简便、快捷等优点，值得临床推广。

图1菌丝KOH湿片法镜下观 (10×40)图2～4菌丝及孢子荧光染色法镜下观 (10×40)

Fig.1Hyphae in KOH Wet MethodFig.2-4Hyphaeand spores in Fluorescent Staining